طبق مقایسه نتایج ضد میکروبی در این پژوهش گزارش می­ شود که عصاره­های متانولی گیاهان بادام کوهی، بومادران، کلپوره، گلپر و مریم گلی و عصاره ترکیبی (بادام کوهی+بومادران) پتانسیل مهارکنندگی بیشتری نسبت به باکتری­ های گرم مثبت باسیلوس سرئوس و استافیلوکوکوس اورئوس داشتند. زیرا تفاوت­هایی که در پوشش سلولی باکتری­ های گرم مثبت و منفی وجود دارد، انتظار می­رود که پاسخ این دو به حلال­های آلی یکسان نباشد [۱۰۲].
مقاومت باکتری­ های گرم منفی نسبت به عصاره­های متانولی حاضر، مطابق با پژوهش­های محققین دیگر می­باشد. در مطالعات مربوط به میکروارگانیسم­های مقاوم دو مکانیسم اصلی برای توضیح مقاومت در باکتری­ ها به خصوص باکتری اشرشیا کلی، سودوموناس و سالمونلا وجود دارد. مکانیسم اول شامل تغییر در ترکیب غشای سلولی به منظور کاهش نفوذ حلال و مکانیسم دوم از طریق انتقال مولکول­های حلال به بیرون دو لایه لیپیدی که باعث کاهش تجمع حلال آلی در غشای داخلی می­ شود [۱۰۳]. هم­چنین گزارش شده است که باکتری­ های گرم منفی در پاسخ به حلال­های آلی و سایر استرس­های محیطی، مرفولوژی و شکل کلی سلول را تغییر می­ دهند [۱۰۴]. به هم ریختن مرفولوژی سلول نشان­دهنده تغییرات بزرگ در متابولیسم و ترکیب غشایی سلول باکتری می­باشد [۱۰۵، ۱۰۶].

سطح تحمل ذاتی هر میکروارگانیسم برای یک حلال آلی خاص به طور ژنتیکی تعیین می­ شود و می ­تواند تحت تاثیر فاکتورهای محیطی نیز قرار بگیرد. بنابراین عقیده بر این است که تحمل حلال آلی یک ویژگی خاص هر سویه است [۱۰۷].
پژوهش ضد میکروبی حاضر نوعی تست غربالگری است که اثرات مهاری ۵ عصاره مورد بررسی به همراه عصاره ترکیبی بر روی باکتری­ های گرم مثبت و منفی انتخابی بررسی شد. در این مطالعه، اثرات ضد میکروبی به ۲ روش دیسک دیفیوژن و رقت در آگار بررسی شد. در روش دیسک دیفیوژن از غلظت­های ۱۰۰۰، ۷۵۰، ۵۰۰، ۲۵۰ و ۱۲۵ میلی­گرم بر میلی­لیتر که مقدار استفاده شده در هر دیسک ۲۰ میکرولیتر عصاره بود، استفاده شد و اثرات آن­ها با ۷ آنتی­بیوتیک استاندارد (کنترل مثبت) و نیز حلال DMSO (کنترل منفی) مقایسه شد. نتایج حاصل نشان می­دهد که کلیه عصاره­ها بر روی باکتری­ های گرم مثبت تحقیق اثر مهاری دارند و به جز عصاره گیاه کلپوره، سایر عصاره­ها نیز مانع رشد باکتری­ های گرم منفی شدند. نتایج آنالیز واریانس حاکی از آن بود که سویه­های باکتریایی از نظر حساسیت در برابر اثر بازدارندگی عصاره­ها دارای اختلاف معنی­داری می­باشند. نمودارهای مربوط به اثرات ضد میکروبی در فصل سوم قدرت ضد باکتریایی عصاره­های متانولی بادام کوهی، بومادران، کلپوره، گلپر، مریم گلی و عصاره متانولی ترکیبی را علیه باکتری­ ها در غلظت­های مشخص نشان می­دهد. نتایج آماری حاصل از مقایسه غربالگری ضد باکتریایی عصاره­ها نشان داد که بیشترین قطر هاله عدم رشد باکتری به ترتیب مربوط به باسیلوس سرئوس و استافیلوکوکوس اورئوس، و کمترین قطر هاله مربوط به سالمونلا انتریتیدیس می­باشد. در تمامی رقت­ها قطر هاله عدم رشد در عصاره­ها دارای اختلاف معنی­داری با سایر رقت­ها دارد. حلال مورد استفاده برای آماده ­سازی عصاره­ها که به عنوان کنترل منفی مورد آزمون قرار گرفت، هیچ فعالیتی از خود نشان نداد.
این تحقیق نشان داد که عصاره کلپوره تنها در برابر باسیلوس و استافیلوکوکوس اثر مهارکنندگی از خود نشان داد و عصاره بومادران هیچ­گونه فعالیتی در مهارکنندگی میکروارگانیسم سالمونلا انتریتیدیس نداشت. می­توان این­گونه نتیجه را حاصل مکانیسم­های مقاومتی باکتری سالمونلا انتریتیدیس دانست.
عصاره متانولی ترکیبی و پس از آن عصاره بادام کوهی در مقایسه با سایر عصاره­ها بر علیه باکتری­ ها به طور قابل توجهی فعالیت ضد باکتریایی بالاتری نشان دادند. اثر مهارکنندگی عصاره­های بومادران و گلپر علیه باکتری­ های گرم مثبت و باکتری اشرشیا کلی در غلظت­های مشخص تفاوت معنی­داری ندارند اما نسبت به فعالیت ضد باکتریایی عصاره بادام کوهی به میزان قابل توجهی پائین­تر می­باشند (P<0.05). نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد، عصاره­ها به صورت قابل توجهی روی باکتری­ های گرم مثبت اثر مهاری دارند که احتمالا حساسیت میکروارگانیسم­های گوناگون به مواد ضد میکروبی به علت ساختار متفاوت میکروارگانیسم­ها می­باشد.
علت حساسیت بیشتر باکتری­ های گرم مثبت به عصاره­های متانولی مورد مطالعه را می­توان به تفاوت در ساختار دیواره باکتری­ ها ارتباط داد زیرا مشخص شده است که زیاد بودن لایه­ های پپتید و گلیکان در دیواره گرم مثبت­ها، آن­ها را، نسبت به داروها و مواد میکروب­کش حساس­تر از باکتری­ های گرم منفی نموده است. باکتری­ های گرم منفی به علت پیچیدگی ساختار دیواره سلولی و به ویژه وجود غشای خارجی و فضای پری­پلاسمیک، عموما در برابر مواد و عوامل میکروب­کش مقاومت بالایی دارند که نتایج این مطالعه نیز آن را تایید می­ کند [۱۰۸].
افزایش قطر هاله عدم رشد با افزایش غلظت عصاره­های متانولی گیاهان انتخابی در این مطالعه، رابطه مستقیم داشت و نشان از تاثیر غلظت­های مختلف عصاره در اثر ضد میکروبی دارد. در مطالعات متعددی [۱۰۹، ۱۱۰] با تغییر میزان غلظت عصاره، اثرات ضد میکروبی گیاهان تغییر کرده است. غلظت، ویژگی­های ساختاری ترکیبات فنلی از جمله نوع، تعداد و موقعیت گروه ­های استخلافی در حلقه بنزن، نوع و مکانیسم عمل این ترکیبات در عصاره­های گیاهی از عوامل مؤثر در ایجاد اختلاف در فعالیت ضد میکروبی عصاره­ها می­باشند [۱۱۱]. محققین اظهار داشتند که وجود زنجیره پروپنوئیک (-CH=CH-COOH) در مشتقات هیدروکسی سینامیک اسید باعث کاهش قطبیت این ترکیبات نسبت به مشتقات هیدروکسی بنزوئیک اسید و در نهایت ورود راحت­تر این ترکیبات به سلول می­گردد. از سوی دیگر این زنجیره با زوائد لیپیدی موجود در سطح غشاء واکنش داده و باعث خنثی­سازی پتانسیل غشا و ورود راحت­تر سایر مواد به سلول می­گردد [۱۱۲].
محققین پژوهش­های فراوانی را در زمینه تعیین فعالیت ضد میکروبی عصاره­های فنلی استخراج­شده از منابع گیاهی مختلف انجام داده­اند. نتایج به­دست آمده از این پژوهش­ها حاکی از آن است که اثرات ضد میکروبی عصاره­های گیاهی عمدتا مربوط به حضور ترکیبات فنلی می­باشد. مکانیسم­های مختلفی برای توجیه رفتار ضد میکروبی ترکیبات فنلی بیان شده است. ترکیبات فنلی ضمن تداخل با غشای فسفولیپیدی دو لایه‌ای، نفوذپذیری غشای سلول­های میکروبی را تحت تاثیر قرار داده و موجب خروج ترکیبات درون سلولی می­گردند [۱۱۳]. علاوه بر این، این ترکیبات منجر به تغییر در عملکرد غشاء جهت انتقال الکترون و یا دریافت نوترینت­ها و اختلال در سنتز پروتئین و فعالیت آنزیم­­ها می­شوند [۱۱۴].
اثر ضد باکتریایی بالای عصاره ترکیبی حاوی عصاره­های متانولی بادام کوهی و بومادران علیه باکتری­ های مورد مطالعه حکایت از پتانسیل بالای این عصاره برای کنترل میکروب­های مقاوم به دارو دارد. آنالیز فعالیت­های مهاری عصاره بادام کوهی نشانگر آن است که میزان مهار، وابسته به میزان ترکیبات فنلی آن است و در ترکیب با عصاره بومادران اثرات سینرژیک افزایش می­یابد.
بررسی­ها نشان داده­اند که پدیده افزایش یا اثرهای توام فعالیت ضد میکروبی ترکیبات شیمیایی موجود در عصاره­های گیاهی دارای اهمیت است و در برخی موارد تفکیک ترکیبات، سبب از دست­دادن فعالیت آن­ها می­ شود. هم­چنین ایجاد مقاومت باکتریایی در برابر داروهای ترکیبی مانند عصاره­های گیاهی در مقایسه با داروهایی که از یک ترکیب ساخته شده ­اند، آهسته­تر است [۱۱۸-۱۱۵].
در بررسی دیگری مشخص شد، عصاره ارگانو و کران بری اثر ضد میکروب (H. pylori) دارند. مشاهدات نشانگر آن بود که فعالیت ضد میکروبی در مخلوط عصاره­ها بیش از عصاره هر ادویه به تنهایی بود. هم­چنین احتمالا به دلیل سینرژیستی فنل­های ارگانو و کران بری، مخلوط آن­ها مهار بیشتری نسبت به ترکیبات خالص هر ادویه ایجاد نمود. این پژوهشگران پیشنهاد کردند که ممکن است مکانیزم این اثر به دلیل مهار آنزیم اوره­آز و مختل نمودن تولید انرژی در باکتری باشد [۱۱۹].
اثر ضد باکتریایی گیاهان مورد مطالعه با مطالعات گذشته مطابقت دارد. تعدادی از مطالعات محققین به شرح ذیل است.
گیاه بادام کوهی روی میکروب­های استافیلوکوکوس اورئوس، اشرشیا کلی، سودوموناس آئروژینوزا و باسیلوس سابتیلیس مؤثر است. بیشترین اثر مهارکنندگی این گیاه مربوط به اثر آن روی استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس بود [۱۱]. اثرات سیتوتوکسیک بومادران به تری ترپنوئیدها و ترکیبات فنلی و فلاونوئیدهای موجود در آن به خصوص کوئرستین و روتنوئید نسبت داده می­ شود. محققین اظهار داشتند که عصاره کلروفرمی بومادران دارای بیشترین توکسیسیتی بود که می ­تواند دارای بیشترین فعالیت بیولوژیکی باشد و از آن می­توان جهت استخراج ترکیبات سمی با خاصیت بیولوژیک بهره جست [۱۲۰]. با توجه به مطالعات انجام گرفته بر روی گونه­ های متفاوت گیاه بومادران و شناسایی مواد مؤثر آن و نوع اثرات این مواد [۱۲۳-۱۲۱] می­توان تصور کرد که اثر کشندگی دوزهای اسانس و عصاره گل بومادران به دلیل فعالیت ترکیب کومارین موجود می­باشد. محققان روی اثر ضد باکتریایی گیاه T. Polium مطالعاتی انجام داده و آزمایش­هایی به منظور بررسی اثر ضد میکروبی اسانس و عصاره گیاه فوق روی چند میکروارگانیسم انجام شد و به ماهیت ضد میکروبی گیاه پی بردند. Samec و همکاران در سال ۲۰۱۰ نشان دادند که اسانس گیاه T. Arduini روی باکتری­ های گرم مثبت مثل استافیلوکوکوس اورئوس بیشترین تأثیر مهارکنندگی داشته در صورتی که دارای هیچ گونه اثر بازدارندگی روی باکتری­ های گرم منفی نظیر E. coli نمی ­باشد [۲۲]. عصاره گیاه کلپوره روی باکتری­ های گرم مثبت نظیر استافیلوکوکوس اورئوس و باسیلوس سوبتیلیس اثر قابل ملاحظه­ای داشته و روی اشرشیا کلی (گرم منفی) اثری نداشت [۱۰]. این نتایج با نتایج تحقیق حاضر کاملا مطابقت دارد.
مطالعات فراوانی نشان از اثرات ضد باکتریایی عصاره گلپر علیه تعدادی از باکتری­ های بیماری­زا دارد [۱۲۴، ۱۲۵].
اسانس گیاه مریم گلی که در حد فراوان ۱ و ۸-سینئول و آلفا-پینن دارد، علیه ۶ سوش میکروبی معمول و ۳ سوش قارچ بیماری­زا اثرات ضد میکروبی قابل توجّهی نشان داده است [۱۲۶]. در مطالعه­ ای دیگر اثر ضد باکتریال اسانس و عصاره متانولی گیاه S. Muticaulis و هم­چنین S. Cryptantha بررسی شده که نتایج حکایت از اثر ضد باکتریایی زیاد اسانس در کلونی باکتری­ های استافیلوکوکوس اورئوس و استرپتوکوکوس پنومونیه موجود در فرآورده ­های غذایی دارد [۱۲۷]. هم­چنین خواصّ ضدّ باکتریایی S. Scalared علیه باکتری استافیلوکوکوس اورئوس به اثبات رسیده است [۱۲۸].
۴-۱-۲ فعالیت ضد میکروبی حاصل از تست آنتی­بیوگرام
افزایش روزافزون مقاومت باکتری­ ها به آنتی­بیوتیک­هایی مانند اریترومایسین و تتراسایکلین سبب شده تا تلاش مستمری برای یافتن داروهای جدید ضد میکروبی صورت گیرد. از آن جا که ترکیبات موجود در گیاهان در مقابله با بیماری­ها به بشر یاری رسانده است، شاید برای غلبه بر بیماری­های باکتریایی یکی از طرق درمان می ­تواند روی آوردن مجدد به گیاهان باشد [۴۵]. نتایج به دست آمده از عصاره خام قابل مقایسه با آنتی­بیوتیک­های استاندارد انتخابی در نمودارهای (شکل ۳-۷، ۳-۸، ۳-۹ و ۳-۱۰) نشان داده شده است. در این مطالعه حساس­ترین باکتری گرم مثبت، باکتری استافیلوکوکوس اورئوس و حساس­ترین باکتری گرم منفی، باکتری اشرشیا کلی می­باشد. علت حساس بودن باکتری استافیلوکوکوس اورئوس احتمالا به دلیل وجود ترکیب موکوپپتید در ساختمان دیواره سلولی می­باشد اما دیواره باکتری­ های گرم منفی فقط لایه نازک موکوپپتید را دارند و قسمت اعظم ساختمان دیواره سلولی آن­ها لیپوپروتئین و لیپوپلی­ساکارید است به همین علت در مقابل مواد ضد باکتریایی مقاوم­ترند.
به طور کلی، عصاره­های متانولی بادام کوهی و ترکیبی در مقایسه با سایر عصاره­ها علیه تمامی گونه­ های باکتریایی مورد آزمایش بسیار فعال می­باشند. علت تفاوت در تأثیر آنتی­بیوتیکی، جنس و گونه­ های مختلف گیاهی و نحوه عصاره­گیری می­باشد [۱۳۳-۱۲۹].
تأثیر نداشتن آنتی­بیوتیک­های SXT، TMP و P علیه باکتری­ های باسیلوس سرئوس و اشرشیا کلی و آنتی­بیوتیک TMP و P علیه سالمونلا می ­تواند مؤید مقاوم شدن سویه­های باکتری نامبرده باشد در صورتی که عصاره­های متانولی ترکیبی، بادام کوهی، بومادران، گلپر و مریم گلی اثرات ضد میکروبی قوی روی این باکتری­ ها دارند که می­توانند جایگزین مناسب آنتی­بیوتیک­های مذکور با منشاء گیاهی شوند. امروزه به دلیل تغییر فرم مقاومتی باکتری­ ها و مقاوم شدن آن­ها به آنتی­بیوتیک­های معمول گرایش به جایگزینی آن­ها با آنتی­بیوتیک­های نوین می­باشد و از بین آن­ها اخیرا فرآورده ­هایی با منشا گیاهی که فعالیت ضد میکروبی از خود نشان می­ دهند جایگاه ویژه پیدا کرده است [۱۳۴، ۱۳۵].
با توجه به این نتایج به نظر می­رسد اثرات ضد باکتریایی گیاهان فوق مربوط به مواد مؤثره­ای مانند آلکالوئید، ساپونین و تانن موجود در عصاره متانولی گیاهان مورد مطالعه باشد. وجود آنتوسیانین فراوان و تانن در عصاره متانولی بادام کوهی و آلکالوئید و تانن در عصاره متانولی بومادران دلیلی بر فعالیت ضد میکروبی این گیاهان می ­تواند باشد.
۴-۱-۳ حداقل غلظت مهارکنندگی (MIC) و حداقل غلظت کشندگی (MBC)
حداقل غلظت بازدارندگی از رشد میکروارگانیسم­های زنده (MIC)، کمترین غلظتی است که در آن کاهش در میزان زنده­مانی باکتری­ های تلقیح­شده در مقایسه با میزان تلقیح اوّلیّه مشاهده می­گردد [۱۳۶]. نتایج حاصل از این تجزیه و تحلیل در جدول ۳-۲ نشان داده شده است.
حداقل غلظت کشندگی از رشد میکروارگانیسم­های زنده (MBC)، کمترین غلظتی است که هیچ­گونه رشدی بعد از کشت مجدد در محیط مایع نداشته و یا غلظتی که ۹/۹۹% از حجم تلقیح اولیه کشته شوند [۱۳۶]. نتایج حاصل از این تجزیه و تحلیل در جدول ۳-۳ نشان داده شده است.
فعالیت ضد میکروبی عصاره­های فنلی مورد مطالعه به روش انتشار در آگار مورد ارزیابی قرار گرفت. این روش کاربرد گسترده­ای در تعیین فعالیت ضد میکروبی عصاره­های گیاهی دارد. بر اساس نتیجه­های به­دست آمده، عصاره­های الکلی به همراه عصاره ترکیبی اثر بازدارندگی قابل توجّهی بر رشد تعدادی از باکتری­ های گرم مثبت و گرم منفی در این پژوهش دارند. اثر ضدّ میکروبی هر عصاره بسته به نوع باکتری و غلظت عصاره متفاوت می­باشد.
کم­ترین مقادیر MIC و MBC متعلق به عصاره­های متانولی ترکیبی و بادام کوهی علیه ۴ سویه باکتری مورد مطالعه می­باشد. یکسان بودن میزان MIC و MBC در عصاره­های ترکیبی و بادام کوهی علیه استافیلوکوکوس اورئوس (۸/۷ میلی­گرم بر میلی­لیتر)، عصاره مریم گلی علیه استافیلوکوکوس اورئوس (۵/۶۲ میلی­گرم بر میلی­لیتر)، عصاره بومادران علیه سالمونلا انتریتیدیس (۵/۶۲ میلی­گرم بر میلی­لیتر) و عصاره گلپر علیه سالمونلا انتریتیدیس (۱۲۵ میلی­گرم بر میلی­لیتر) نشان­دهنده قدرت باکتریسیدال عصاره­ها در رقت­های پائین می­باشد به طوری که همان غلظتی که باعث ممانعت از رشد باکتری­ ها می­ شود سبب کشته­شدن آن­ها نیز می­ شود.
اثر کشندگی عصاره متانولی ترکیبی و بادام کوهی علیه باکتری­ های مورد مطالعه نشان می­دهد که در واقع عصاره بادام کوهی با دارا بودن مقادیر قابل توجهی از ترکیبات فنلی و هم­چنین خاصیت آنتی­اکسیدانی و ضد میکروبی بالا، می ­تواند پتانسیل بالایی جهت کنترل میکروب­های مقاوم به دارو و استفاده در صنعت داروسازی به عنوان جای­گزین افزودنی­های سنتزی داشته باشد.
در تحقیق حاضر، عصاره­های متانولی علیه باکتری باسیلوس سرئوس اثر ممانعت کنندگی از رشد را نشان دادند اما در آزمایش حداقل غلظت کشندگی به استثناء عصاره­های متانولی ترکیبی و بادام کوهی، نتیجه­ای حاصل نشد که می ­تواند به دلیل کمتر بودن میزان دوز عصاره­های تعیین شده از طریق روش رقت در آگار بر میکروارگانیسم باشد. شایان ذکر است که پس از تاثیر عصاره­های متانولی بومادران، کلپوره و گلپر علیه باسیلوس سرئوس اگرچه باکتری کشته نشده است ولی تعداد تک کلونی­های باکتری به میزان قابل توجهی کاهش یافته است (حدودا ۵۰% کمتر شده است). این بدان معناست که اگر چه رشد باکتری باسیلوس سرئوس بیش­تر از سایر باکتری­ های مورد بررسی در غلظت­های پائین مهار می­گردد، اما جهت اعمال اثر کشندگی به غلظت­های بیش­تری از عصاره­ها نیاز است.
مطالعات نشان داده­اند که ویژگی­های آب­دوستی و آب­گریزی ترکیبات مؤثره در عصاره­های گیاهی نقش بسیار مهمی در تعیین فعالیت ضد میکروبی عصاره­ها دارد. برقراری تعادل در ویژگی­های آب­دوستی و آب­گریزی ترکیبات ضد میکروبی جهت عملکرد مناسب آن­ها در ممانعت از رشد میکروارگانیسم­ها ضروری می­باشد. ویژگی­های آب­دوستی، در حلالیت ترکیبات ضد میکروبی در آب به عنوان محیطی برای رشد میکروارگانیسم­ها و ویژگی­های آب­گریزی در نفوذ این ترکیبات به درون غشای میکروبی و برهم کنش آن­ها با غشا مؤثر می­باشد [۱۳۷].
اثر ضد میکروبی عصاره­های استخراج­شده از چای سبز، زیتون و قهوه توسط لوپز- مالو و همکاران (۲۰۰۵) گزارش شد. این محققان اظهار داشتند، ترکیبات فنلی ضمن برهم کنش با ترکیبات لیپیدی غشای سلول­های میکروبی، منجر به تغییر در نفوذپذیری غشاء و در نهایت خروج ترکیبات درون سلولی می­گردند [۱۳۸].
محققین معتقدند که برقراری پیوند هیدروژنی میان گروه ­های هیدروکسیل در ترکیبات فنلی و اسیدهای نوکلئیک در سلول­های میکروبی می ­تواند در غیرفعال شدن مولکول­های DNA مؤثر باشد [۱۳۹].
وجود مقادیر زیادی از ترکیبات فنلی در عصاره­های متانولی مورد مطالعه بی­شک محکم­ترین دلیل برای اثر ضد میکروبی این عصاره­ها بر روی میکروارگانیسم­های عامل بیماری می­باشند.
وونگ و کیتس (۲۰۰۶)، حضور ترکیبات فنولیک را در عصاره برگ جعفری عامل اصلی فعالیت ضد باکتریایی عصاره در برابر باکتری­ های گرم مثبت (گونه­ های لیستریا و میکروکوکوس) و گرم منفی (گونه­ های اشرشیا و اروینیا) دانستند. آن­ها اظهار داشتند این ترکیبات با تاثیر بر مولکول­های DNA و تغییر در ساختار آن­ها، مانع از رشد باکتری­ ها می­گردند. این پژوهشگران، توانایی ترکیبات فنلی در شلاته­کردن فلزات انتقالی و کاهش قابلیت دسترسی زیستی به یون­های فلزی ضمن تشکیل کمپلکس با آن­ها را از دیگر دلایل در توجیه اثر ضد باکتریایی عصاره­های حاصل از دو گیاه جعفری و گشنیز دانستند. علاوه بر این، به عقیده آن­ها ظرفیت احیاکنندگی عصاره­های گیاهی می ­تواند منجر به کاهش پتانسیل اکسایش-کاهش محیط رشد میکروارگانیسم­ها و جلوگیری از رشد باکتری باسیلوس سابتیلوس گردد [۱۴۰].
۴-۲ خواص فیتوشیمیایی عصاره­های مورد بررسی
۴-۲-۱ فیتوشیمیایی کمی
متابولیت­های ثانویه از بیوسنتز متابولیت­های اولیه به دست می­آیند و به عنوان ترکیبات فرعی و انتهایی متابولیسم اولیه در نظر گرفته می­شوند. مهم­ترین متابولیت­های ثانویه آلکالوئیدها، روغن­های ضروری، استروئیدها، لیگنین­ها، تانن­ها، فلاونوئیدها و فنل­ها می­باشند [۱۴۱]. ترکیبات فنلی گروه بزرگی از مواد طبیعی گیاهی شامل تانن­ها، آنتوسیانین­ها و غیره می­باشند که معمولا در میوه­ ها، سبزیجات، آجیل­ها، برگ­ها، دانه­ها، ریشه و سایر قسمت­ های گیاه دیده می­شوند. این مواد منافع قابل توجهی در زمینه مواد غذایی، شیمی، داروسازی و پزشکی با توجه به طیف گسترده­ای از اثرات مطلوب زیستی از جمله خواص آنتی­اکسیدانی دارند [۱۴۲]. اگر چه غالب گیاهان از منابع مهم آنتی­اکسیدان­ها هستند، ولی سمّیّت بسیاری از گیاهان به خاطر وجود ترکیبات فیتوشیمیایی گزارش شده است [۱۴۳].
نتایج غربالگری آزمایش­های فیتوشیمیایی حاصل از ارزیابی آلکالوئید، آنتوسیانین، تانن و ساپونین به ترتیب در جدول­های ۳-۴، ۳-۵، ۳-۶ و ۳-۷ برای عصاره­های متانولی مورد مطالعه نشان داده شده است. با توجه به نتایج این تحقیق، گیاهانی که دارای توانایی آنتی­اکسیدانی بالایی هستند پتانسیل خنثی­کردن رادیکال­های آزاد موجود در بدن را دارند که در این پژوهش، بیشترین خاصیت ضد رادیکالی و ضد اکسیدانی به­ترتیب ناشی از عصاره بادام کوهی و بومادران می­باشد.
تاکنون تحقیقی در ارتباط با مطالعات فیتوشیمیایی اجزاء تشکیل­دهنده عصاره بادام کوهی صورت نگرفته است اما مطالعات فیتوشیمیایی عصاره­های گونه­ های دیگر گیاهان مورد مطالعه به شرح ذیل می­باشد.
بومادران حاوی ترکیبات آلکالوئیدی، فلاونوئیدی، استرول، تانن، روتئین و غیره می­باشد [۱۴۴]. در بررسی ­های انجام شده روی گیاه کلپوره مشخص شده که این گیاه حاوی مقادیری تانن، ترپنوئیدها، ساپونین، استرول، فلاونوئیدها، گلیکوزید، آلفا و بتا پینن و لوکوآنتوسیانین است [۲۲، ۱۴۵]. وجود فلاونوئید به­همراه مقداری از تانن و ساپونین در بررسی فیتوشیمیایی گلپر نیز به اثبات رسیده است [۱۴۶]. نتایج محققین با نتایج حاصل از آزمایشات حاضر ارتباط دارد.
۴-۲-۲ ارزیابی محتوی فنل
در سال­های اخیر ثابت شده است که رادیکال­های آزاد مهم­ترین عوامل اکسیدکننده مواد غذایی (که با روند تخریبی باعث از بین­رفتن ارزش غذایی و تغییر در ترکیب شیمیایی آن­ها می­گردد) می­باشند [۱۴۷، ۱۴۸]. به ­طوری که علاوه بر اثرات نامطلوب ارگانولپتیک در محصولات غذایی، با از بین­رفتن ویتامین­ها و اسیدهای چرب ضروری بدن و ایجاد ترکیبات سمی می­توانند منجر به اثرات نامطلوب از قبیل بیماری­های التهابی، دیابت ملیتوس، ایسکمی قلبی و مغزی، سرطان، نقص ایمنی و پیری در بدن انسان بشوند [۱۵۲-۱۴۸].
از بین ترکیبات گیاهی که دارای خواص آنتی­اکسیدانی می­باشند، ترکیبات فنلی توزیع گسترده­ای در بسیاری گیاهان دارند. پلی­فنل­ها ساختار شیمیایی مناسبی برای فعالیت پالایشی رادیکال­های آزاد دارند. خصوصیات آنتی­اکسیدانی فنل­ها، ناشی از فعالیت بالای این ترکیبات به عنوان دهنده الکترون یا هیدروژن و توانایی آن­ها در پایداری، نامتمرکز کردن الکترون­های جفت نشده و نیز شلات یون­های فلزی می­باشد. ترکیبات فنلی از طریق اهدا الکترون به رادیکال­های آزاد واکنش­های اکسیداسیون چربی را مهار می­ کنند [۱۵۳].
در این مطالعه، میزان ترکیبات فنلی عصاره­های استخراج­شده مورد مطالعه به روش فولین سیوکالتیو اندازه ­گیری شد. اساس این روش، احیای معرف فولین سیوکالتیو توسط ترکیبات فنلی در محیط قلیایی می­باشد که در نهایت منجر به تشکیل کمپلکس­های آبی­رنگ با حداکثر جذب در طول موج ۷۶۰ نانومتر می­گردد [۱۵۴]. معرف فولین سیوکالتیو به صورت غیر اختصاصی با ترکیبات فنلی واکنش می­دهد. علاوه بر این، به جز ترکیبات فنلی، سایر ترکیبات موجود در عصاره­ها نظیر قندها، آمینواسیدها، ویتامین­ها، اسیدهای آلی، آمین­های اکروماتیک و ویتامین­ها نیز قادر به احیاء این معرف می­باشند [۱۵۵].
نتایج آنالیز واریانس نشان داد غلظت حلال مورد استفاده جهت استخراج تاثیر معنی­داری (P<0.05) بر میزان ترکیبات فنلی عصاره­ها دارد. این نتایج نشان می­دهد میانگین ترکیب فنلی در غلظت ۵۰۰ میلی­گرم بر میلی­لیتر عصاره متانولی بادام کوهی، بومادران، کلپوره، گلپر، مریم گلی و آنتی­اکسیدان سنتزی اسید گالیک به ترتیب ۰۴۸/۰±۸۹۱/۶، ۰۷۳/۰±۸۴۱/۵، ۰۴۷/۰±۱۹۵/۳، ۰۴۱/۰±۴۳۷/۴، ۰۴۲/۰±۹۸۵/۲ و ۰۸۵/۰±۰۰۳/۷ میلی­گرم اسید گالیک در گرم عصاره می­باشد. حضور میزان زیاد ترکیبات فنولیک در عصاره­های بادام کوهی و بومادران دلیلی بر سطوح بالای فعالیت آنتی­اکسیدانی آن­ها می­باشد. در این پژوهش، اختلاف معنی­داری در میانگین ترکیبات فنلی میان عصاره متانولی بادام کوهی و آنتی­اکسیدان سنتزی اسید گالیک در غلظت ۵۰۰ میلی­گرم بر میلی­لیتر مشاهده نشد که این نتیجه حاکی از آن است که برای رسیدن به قدرت آنتی­اکسیدانی، میزان فنل در غلظت ۵۰۰ میلی­گرم بر میلی­لیتر از عصاره متانولی بادام کوهی معادل همان غلظت از اسید گالیک می­باشد. احتمال می­رود تفاوت در میزان ترکیبات فنلی عصاره­ها، به دلیل تفاوت در حلالیت ترکیبات فنلی گونه­ های گیاهی در حلال مورد استفاده و غلظت حلال باشد. تاکنون تحقیقی در ارتباط با استخراج ترکیبات فنلی و فعالیت آنتی­اکسیدانی گیاه بادام کوهی با حلال­های مختلف انجام نشده است اما تحقیقات زیادی در زمینه استخراج این ترکیبات با سامانه­های مختلف حلال از سایر گیاهان مورد مطالعه در این پژوهش صورت گرفته است. محققین حضور ترکیبات فنلی را در گیاه بومادران [۱۵۶]، کلپوره [۲۲، ۱۴۵]، گلپر [۱۴۶] و مریم گلی [۱۰۴] به اثبات رسانیده­اند.
پژوهش­ها نشان داده­اند که روش استخراج، اندازه ذرات ماده، مدت زمان، شرایط نگهداری گیاه، ویژگی­های شیمیایی و ساختاری ترکیبات فنلی، روش و استاندارد مورد استفاده در اندازه ­گیری ترکیبات فنلی، وجود ناخالصی­هایی مانند موم­ها، ترکیبات لیپیدی، کلروفیل­ها، ترپن­ها و نوع حلال مورد استفاده در عصاره­های گیاهی از عوامل مؤثر در تعیین مقدار ترکیبات فنلی عصاره­ها می­باشند [۱۵۷].
متانول حلال مؤثرتری برای تخریب دیواره سلولی و آزادسازی ترکیبات فنلی از سلول­ها می­باشد و آنزیم پلی­فنل اکسیداز مخرب پلی­فنل­ها، در این محیط خنثی می­گردد؛ لذا عصاره متانولی گیاهان بیشترین پتانسیل آنتی­اکسیدانی را در مقایسه با بسیاری از حلال­ها داراست [۱۵۸]. فعالیت آنزیم پلی­فنول اکسیداز در عصاره­های آبی استخراج شده در دمای محیط، می ­تواند دلیل دیگری برای پائین­بودن محتوی ترکیبات فنلی عصاره­ها باشد در حالی که این آنزیم در حلال­های الکلی غیرفعال است [۱۵۹].
در گیاهان، فعالیت آنتی­اکسیدانی با میزان ترکیبات فنلی رابطه مستقیم دارد [۱۶۰]. مشخص شده است که مصرف روزانه ۱ گرم از یک رژیم غذایی غنی از میوه­ ها و سبزیجات که حاوی ترکیبات پلی فنلی است دارای اثرات بازدارنده بر جهش­زایی و سرطان­زایی در انسان می­باشد [۱۶۱]. در غلظت­های بالاتر ترکیبات فنلی به دلیل افزایش تعداد گروه ­های هیدروکسیل موجود در محیط واکنش، احتمال اهداء هیدروژن به رادیکال آزاد و به دنبال آن قدرت آنتی­اکسیدانی عصاره افزایش می­یابد [۱۶۲]. ترکیبات فنلی در غلظت­های خاص، به طور قابل توجهی میزان تشکیل دی­ان­های کونژوگه را کاهش می­دهد. اهمیت ترکیبات فنلی در صنعت مواد غذایی در حال افزایش است زیرا آن­ها موجب تاثیر تخریب اکسیداتیو چربی و در نتیجه بهبود کیفیت و ارزش تغذیه­ای مواد غذایی می­گردند [۱۶۳].
۴-۲-۳ ارزیابی فعالیت آنتی­اکسیدانی
آنتی­اکسیدان­ها بر اساس عملکردشان، به دو گروه اصلی تقسیم می­شوند: آنتی­اکسیدان­های اولیه و آنتی­اکسیدان­های ثانویه [۱۶۴]. آنتی­اکسیدان­های اولیه الکترون یا هیدروژن خود را به رادیکال­های آزاد می­ دهند در حالی که آنتی­اکسیدان­های ثانویه به عنوان همیار عمل می­ کند، یعنی از طریق دادن هیدروژن و بازیابی آنتی­اکسیدان اولیه یا جاروب­کننده­ های اکسیژن و عوامل کلاته­کننده نقش خود را ایفا می­ کنند [۱۶۵].
در سال­های گذشته نیز، تحقیقات زیادی در زمینه خواص آنتی­اکسیدانی و آنتی­رادیکالی گیاهان صورت گرفته است [۱۶۶]. به علت پیچیدگی ترکیب­های موجود در گیاهان، ایجاد یک رابطه بین فعالیت آنتی­اکسیدانی و ترکیب­های گیاهی خاص دشوار است [۱۶۷].