بند دوم: استفاده خطرساز ۷۶
الف) حکم تکلیفی ۷۷
ب) حکم وضعی ۷۷
بند سوم: استفاده اختلال ساز ۷۹
بند چهارم: ساخت مسجد درشوارع عمومی ۷۸
بندپنجم: باز کردن درب به سطح معابر ۷۹
بند ششم :‌حفاری در معابر ۸۰
بند هفتم: خرید و فروش معابر ۸۲
بندهشتم : اتراق کردن در معابر ۸۳
بندنهم : ایجاد لغزندگی در معابر و مسئولیت های ناشی از آن ۸۴
فصل دوم : مسئولیت های ناشی از سد معبردر فقه و حقوق ۸۶
مبحث اول: بررسی فقهی سد معبر ۸۶
گفتار اول : آرا فقهی علمای شیعه ۸۶
گفتار دوم: بررسی حکم وضعی در سد معبر درفقه ۸۸
بنداول: ضمان در سد معبر ۸۹
بند دوم : استفتائات فقهی ۹۴
بندسوم: مبانی فقهی مسئولیت مدنی ناشی از استفاده از گذرگاه های عمومی ۹۵
بندچهارم : خصوصیت گذرگاه های عمومی ۹۶
بند پنجم: کاربری گذرگاه ها ۹۷
گفتارسوم:‌ سد معبر از دیدگاه قانون ۱۰۱
گفتار چهارم:‌ سد معبردر حقوق موضوعه ایران ۱۰۱
بند اول : بررسی ضمان سد معبر از دیدگاه قانون ۱۰۵
بنددوم : آثار حکم وضعی سد معبر ۱۰۶
گفتارپنجم : اقدامات شهرداری ها ۱۰۷
بند اول تبصره ۱ بند ۲ ماده ۵۵ قانون شهرداری ها ۱۰۷
بنددوم :تبصره ۴ بند ۲ ماده ۵۵ قانون شهرداری ها ۱۰۸
بندسوم : بند ۲۰ ماده ۵۵ قانون شهرداریها ۱۰۸
بندچهارم :ماده ۸۵ قانون شهرداریها ۱۰۸
بند پنجم : ماده ۱۰۰ قانون شهرداری ها ۱۰۹
بند ششم :آیین نامه اجرایی تبصره بند ۲۰ ماده ۵۵ قانون شهرداری ۱۱۲
نتیجه گیری ۱۱۷
پیشنهادها ۱۱۸
منابع ۱۲۰
چکیده لاتین ۱۲۵
چکیده
معبر به معنی محل عبور می‌باشد و در معنای اصطلاحی به محلی اطلاق می‌گردد که از آن برای عبور و مرور استفاده می‌شود. معبر در اثر تفکیک اراضی موضوع ماده ۱۰۱ قانون شهرداری ایجاد می‌گردد. سد معبر به هر فعل و ترک فعلی اطلاق می‌گردد که باعث مسدود شدن معابر عمومی می‌گردد به صورتی که عبور و مرور از آن ها به طور دائم یا موقت غیرممکن گردد. هر فردی می تواند به طور مشروع تا جایی که عمل وی باعث اضرار به غیر نگردد از معابر عمومی استفاده نماید و در این ارتباط، قدرت عمومی می تواند از تجاوز اشخاص نسبت به آنها جلوگیری نماید. بر اساس قانون شهروندی، استفاده از معابر عمومی، میدان‌ها، پارک ها و باغ های عمومی حق طبیعی هر شهروند می‌باشد و هیچکس نمی‌تواند مانع این استفاده مشروع گردد. شهرداری به موجب قانون وظیفه حفظ و نگهداری معابر را دارد به همین اندازه مسئولیت خسارات ناشی از عیب یا سد معبر را به عهده دارد. در جایی که شخصی معبر عمومی را سد کرده باشد و با این کار باعث ورود خسارت به دیگران شود رکن اول که فعل زیانبار است را دارد و فعل دوم نیز ضرری است که به فرد وارد شده است. پس فقط اگر وجود رابطه سببیت میان این فعل زیانبار و ضرر وارده اثبات شود مسئولیت می‌تواند بر شخص حقیقی و یا حقوقی زیان زننده بار شود. در این پایان نامه مسئولیت مدنی ناشی از سد معبر در حقوق ایران بررسی می شود.

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

کلمات کلیدی:
مسئولیت مدنی، معبر، سد معبر، خسارت، تقصیر
بخش اول
کلیات پژوهش
۱- مقدمه

امروزه پدیده ناهنجار سد معبر یکی از مشکلات لاینحل شهرداری ها محسوب می‌گردد. هر روزه افراد بسیاری با استفاده نامتعارف از معابر عمومی مانع از اعمال حق عمومی می‌گردند که شهرداری و مأموران آن مکلف به رسیدگی و جلوگیری از انسداد معبر و رفع سد معبر می‌باشند. لیکن انجام این تکلیف قانونی همواره با مشکلات زیادی روبرو بوده است و ما هر روز شاهد درگیری میان مأموران شهرداری و افراد متخلف می‌باشیم. چرا که به نظر می‌رسد ضمانت اجرای کافی جهت ارتکاب این تخلف در قانون موجود نمی‌باشد. از این رو اقتضاء می کند که مسئله سد معبر در ایران که موضوع تبصره یک بند دو ماده ۵۵ قانون شهرداریها می باشد. شهرداری موظف است راسأ به وسیله مأمورین خود اقدام نماید.
برابر تبصره ۱ بند ۲ ماده ۵۵ و تبصره ۶ ماده ۹۶ قانون شهرداری ها تمام معابر و شوارع و خیابان ها، پارک ها وباغ های عمومی ملک عمومی و در مالکیت شهرداری ها می باشد و استفاده از آنها برای کسب یا سکنی و یا هر عنوان دیگر ممنوع است و شهرداری مکلف است از آن جلوگیری و در رفع موانع موجود و آزاد نمودن معابر و اماکن مذکور فوق به وسیله مأمورین خود راساً اقدام کند.
۲- بیان مسئله
معبر همانطور که از نامش پیداست به معنی محل عبور می‌باشد و اصطلاحاً به محلی اطلاق می‌گردد که از آن برای عبور و مرور استفاده می‌شود و در اثر تفکیک اراضی موضوع ماده ۱۰۱ قانون شهرداری ایجاد می‌گردد. سد معبر به هر عملی اطلاق می‌شود که باعث انسداد معابر عمومی می‌گردد، به طوری که عبور و مرور از آن ها به طور دائم یا موقت، غیرممکن یا دشوار گردد. در این زمینه شناخت معبر و شناخت مصادیق انسداد آن بایستی مورد مطالعه دقیق قرار گیرد چون که مصادیق آن در قانون به صورت تمثیلی می باشد. در واقع شهرداری موظف است از معابر به عنوان یک ملک عمومی حفاظت کند و همواره آن را برای استفاده عموم آماده نگهداشته و از تجاوز اشخاص نسبت به آنها جلوگیری نماید. استفاده از معابر عمومی، میدان‌ها، پارک ها و باغ های عمومی حق طبیعی هر شهروند می‌باشد و هیچکس نمی‌تواند مانع این استفاده مشروع گردد. اصل ۴۰ قانون اساسی ایران مقرر می دارد: «هیچ کس نمی‌تواند اعمال حق خویش را وسیله اضرار به غیر یا تجاوز به منافع عمومی قرار دهد». در این بین شناخت مدعی و نحوه طرح دعوی و چگونگی مراجعه به مراجع صالحه از اهمیت زیادی برخوردار می باشد که باید مورد مطالعه دقیق قرار گیرد.
سد معبر دارای اشکال گوناگونی است. از مصادیق سد معبر می‌توان از سد معابر توسط دست فروشان، نصب دکه‌های غیرمجاز، تخلیه نخاله، ریختن مصالح، آجر و سیمان در معابر عمومی بدون مجوز شهرداری، توقف اتومبیل در مکان های غیرمجاز، وسایل نقلیه جهت فروش کالا، اشغال پیاده روها و میادین توسط افرادی که از آنجا به عنوان محل سکونت استفاده می‌کنند نام برد. این گونه تخلفات می‌تواند موجبات سد معابر عمومی، اشغال پیاده روها و استفاده غیرمجاز از آنها و میادین و پارک‌ها و باغهای عمومی را فراهم آورد.
امروزه پدیده ناهنجار سد معبر یکی از مشکلات مبتلا به جوامع محسوب می‌گردد. هر روزه افراد بسیاری با استفاده نامتعارف از معابر عمومی، مانع از اعمال حق عمومی می‌گردند که مسئولان مکلف به رسیدگی و جلوگیری از انسداد معبر و رفع سد معبر می‌باشند. انجام این تکلیف قانونی همواره با مشکلات زیادی روبرو بوده است و در بسیاری از موارد شاهد درگیری میان مأموران شهرداری و افراد متخلف می‌باشیم. به نظر می‌رسد ضمانت اجرای کافی جهت ارتکاب این تخلف در قانون موجود نمی‌باشد. از این رو اقتضاء دارد که مسئله سد معبر در ایران که موضوع تبصره یک بند دو ماده ۵۵ قانون شهرداری می‌باشد، با مطالعه دقیق مورد بررسی قرار گیرد.

معنی: باران نم­نم ببار که زمین ما ترک­ترک شد
tarakNam nam bezan ke oške zemi mo tarak
آدِه اَکنگ پَنگِ فَسیلُم خَرک خَرک
معنی: و دوباره به خوشه­های درخت نخل خرما بده.
Ade akangepang efasilom xarak xarak
چو مَحرِضا^[۱۸] و اُژزَت اَزَخم دِلُم نمک
معنی: مانند محمدرضا به زخم دلم نمک زده.
Čomahreza-o- ojjzat a za xme dalom namak
جَنکوک^[۱۹] روشنای دِلِ شو تارنی
معنی: جنکوک دیگر روشنی بخش شب­های تاریک نیست.
janjookerošanayedelešowetarni.
چیرشت مَزدِل اُند اَبَرا اِنکه لارنی
معنی: فریاد از ته دلم بالا آمد که این جا لار نیست.
Čirešt maz del ond a bara enke larni.
نَم نَم اَلو کَفَ تو بریُزش بهار اَبو
معنی: نم نم بر روی دشت بباری بهار می­ شود
Nam nam aloo kafa tave berizoš bahar aboo.
اُرما دووارهَ تاجِ سِرَش و اکُفار اَبو
معنی: خرما دوباره به خوشه ­ها زینت می­بخشد.
Orma dovara taje seraš vakofar aboo.
کوگ و دُمیل مَحرَمِ چِنگِ کُنار اَبو
معنی: کبک و دُمیل دوباره محرم شاخه کنار می­ شود.
Kowg-o- domil mahram-e- čenge konar aboo .
بویِ خَشِ نَمِ تو وُ عطر دُوار اَبو
بوی خوش نم تو و عطر دیوار می ­آید.
Booye xaše name to-o- atre dovar aboo.
وارو^[۲۰] بِدا که واَقَدمُتْ لار، لار اَبو
بلند شو بیا که با قدم­هایت لار دوباره لار می­ شود.
Varo beda ke va qadamot larT lar aboo
فصل چهارم
عناصر ادبیات عامّه در منطقه هرمود لارستان
پیش در آمد
دوبیتی (ترانه) به دلیل مردمی بودن، دارای زبانی ساده، نرم، لطیف و نزدیک به زبان محاوره و گاه آمیخته با زبان کهن و سنتّی است. درون مایه دوبیتی عاشقانه و عارفانه است. باباطاهر همدانی و فایز دشتستانی در این قالب شهره­اند. در این فصل دو بیتی­ها را که در زبان محلّی به آن«شَلْوا» می­گویند را به چند گروه: عاشقانه، غریبانه و شکوائیه، پیری و جوانی، پدر و مادر و مرثیه و دو بیتی­های دینی و مذهبی تقسیم کرده­ایم و دو بیتی­های «محیا» شاعر لارستانی زبانزد اهالی است. اشعاری که تقریباً همه گروه سنّی در این منطقه بر زبانشان جاری است، مخصوصاً بزرگترها که بسیار عالی این دو بیتی­ها را می­خوانند. در این میان به جوانی به نام «حسن لقمان­زاده» برخورد کردم که بسیار زیبا با نواختن نی، شلوا می­خواند که تأثیر آن در عمق جان و روح انسان را نمی­شد درست کم گرفت.
لالایی­ها متأسفانه کم­کم می­رود که به دست فراموشی سپرده شود، زیرا دیگر کمتر مادری برای کودکش لالایی می­خواند و حتی کمتر به یاد دارند. فقط در این میان عده­ای مادر بزرگ­ها هستند که هنوز هم با زمزمه شیرین لالایی، نوه­های خود را با آرامش به دست خواب می­سپارند.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

نفرین­ها و دعاها، اصطلاحات عامیانه، معّما و چیستان،‌ کنایه، مَثَل­ها و زبانزد نیز در این فصل گنجایش شده است. مَثَل­ها و زبانزدها در بین مردم بسیار رایج است و در موقعیت­های مختلف از آن استفاده می­ شود و نقش پررنگی در ادبیات عامۀ این منطقه و گویش شیرین محلّی آن­ها دارند. ‌تعداد تقریباً زیادی ضرب المثل و کنایه توسط نگارنده، جمع­آوری شده که حائز اهمیت است.
داستان­ها و افسانه­ها که در منطقه صحرای باغ و روستا­های اطراف و حتی در نقاط مختلف کشور پهناورمان نقل می­ شود، مربوط به نسل­های گذشته و نسلی است که شب­های دراز زمستان و گرم تابستان دور هم جمع می­شدند و خسته از فعالیّت­های روزانه به قصه­های قصه­گویان و دو بیتی­هایی که در جنوب به آن شلوا گفته می­ شود، گوش می­دادند و در بسیاری از موارد شلوا­های خواننده را یک نفر نی­زن ماهر با نواهای دل­انگیز خود، همراهی می­کرد. قصه­ها معمولاً توسط مادر بزرگ­ها برای بچه­ها و نوه­ها نقل می­شد؛ امّا بزرگترها نیز با علاقۀ فراوان به آن گوش می­کردند. قصه در هرمود و روستاهای اطراف به «گَپِ شو» یعنی «حرف­های شبانه» معروف است. امروزه متأسفانه به سبب اشتغال زیاد دیگر کمتر مردم می­توانند دور هم جمع شوند و قصه را از قصه­گو بشنوند یا به شلواهای شلواگو و صدای دل انگیز و روح بخش نی گوش دهند. هر چند انسان نمی­خواهد مزایای تمدّن جدید را منکر شود ولی واقعیت این است که صفا و صمیمّیت قصه­گوی قدیم، چیز دیگری بود. قصه هایش تا مغز استخوان نفوذ می­کرد و بر جان و دل می­نشست و آرامش عجیبی به انسان می­داد. افسوس که می­روند تا به ورطه­گاه نسیان و فراموشی سپرده شوند.
افسوس که دیگر عطر نوای روح بخش «نی» و صدای دل­انگیز مادر بزرگ قصه­گو و موسیقی دل انگیز لالایی­ها کمتر بر جویبار دل­هایمان جاری می­ شود. افسوس…
به همین دلیل قصه­ها و افسانه­هایی که نگارنده در این فصل آورده است، بسیار کم است.
۴-۱ لالایی­ها
«لالایی­ها در حقیقت ادبیات شفاهی هر سرزمینی هستند، چرا که هیچ مادری آن­ها را از روی نوشته نمی­خواند و همه مادران بی­آنکه بدانند از کجا و چگونه آن-ها را می­خوانند. انگار داشتن لالایی و لحن ویژه آن – از روز نخست – برای روان زن تدارک دیده شده است. شاید بتوان گفت: لالایی طیف­های رنگارنگی از آرزوها، گلایه­ها و نیایش­های معصومانه مادرانه هستند که سینه به سینه و دهان به دهان از نسل­های پیشین گذشته تا به امروز رسیده و هنوز هم تا حدودی طراوت و تازگی خود را حفظ کرده ­اند، به گونه ­ای که تاکنون هیچ ترانۀ دیگری نتوانسته جایشان را بگیرد.
باری انسان در لالایی­ها آرزوهای سرکوب شده و برآورد نشدۀ خود را می­جوید و سرنوشت نیاکان خود را جستجو می­ کند. لالایی­ها مالامال از مقاومت خشم، آرزو، اعتقادات مذهبی، دینی و قومی و سرشار از تلاشی گسترده و مداوم جهت برپاکردن زندگی شرافتمندانه هستند. نخستین پیمان آهنگین و شاعرانه­ای که میان مادر و کودک بسته می­ شود. رشته­ای نامرئی که از لب­های مادر تا گوش­های کودک می­پوید و تأثیر جادویی آن خواب ژرف و آرامی است که کودک را فرا می­گیرد. رشته­ای که حامل آرمان و آرزوهای صادقانه و بی­وسواس مادر است و تکان­های دمادم گاهواره بر آن رنگی از توازن و تکرار می­زند و این آرزوها چنان بی­تشویش و ساده بیان می­شوند که ذهن شنونده در این که آن­ها آرزوها هستند یا واقعیت، بی­تصمیم و سرگردان می­ماند. انگار که مادر با تمامی قلبش می­خواهد که بشود و می­ شود.
در حقیقت «لالایی­ها- این دیرپاترین ترانه­های فولکلوریک- آغازگاه ادبیات زنانه در پای گاهواره­ها هستند که قدمتشان دیگر تاریخی نیست بلکه باستان شناختی است.
پَسیــنی مــن بــرم بــونِ بلــندی ببنــدم نَــنِــنِ خیـــلی قشــنگی
بشینم پهلــوی نَنی شعــری بخونم بـــرای خــاطر یَــک سبزه رنگی
لالا لالا لالا لالا لالایی
پسینی کــه گــلم رفته بــه بــالا خــوراک مــن بُدِ یَک بــرگ نعنا
الــهی بــرگ نــعنا خشک بگرده کــه رودُم رفتــه و مَ مونده تَهــنا
لالا لالا لالا لالا لالایی
چــرا هــمراه اَفتــاب کوه نرفتــم چــرا همــرای گــلِ خوشبو نرفتم
همان ساعت که رودم لالایی می­گفت چــرا همــراه لالا پیــش خو نرفتم

الف
ب
نگاره ۳-۲: الف- نمونه­برداری از ماهیچه (بیوپسی)، ب- بخیه ساده پس از نمونه‎برداری.
۳-۱-۳- نمونه گیری از ماهیچه دوسر ران (پس از کشتار)
پس از کشتار، بره­ها در مدتی کمتر از ۵ دقیقه به­سرعت پوست­کنی شدند، یک نمونه ۳۰-۲۰ گرمی از ماهیچه دوسر ران (پای راست) جدا پس از زدودن خون سطحی (با بهره گرفتن از کاغذ)، چربی­های سطحی از ماهیچه جدا شد. آنگاه نمونه‎ در نیتروژن مایع یخ زده، و در دمای ۸۰- درجه سانتی ­گراد نگهداری شد.
۳-۲- اندازه ­گیری­های آزمایشگاهی
جداسازی، تعیین غلظت میتوکندری و اندازه ­گیری فعالیت مجموعه­های آنزیمی زنجیره­ تنفسی میتوکندری در پژوهشکده­ زیست فن­آوری دانشگاه شیراز انجام ­شد. بیشتر مواد شیمیایی از شرکت (Co., St. Louis, MO, Inc) Sigma-Aldrich و تعداد اندکی مواد شیمیایی (اتانول و فسفریک اسید) از شرکت Merck (Co, Whitehouse, NJ.) خریداری شدند.
۳-۲-۱- جداسازی میتوکندری
در بسیاری از موارد برای بررسی کنش و ساختار یک اندامک، لازم است آن را از سیتوزول و اندامک­های دیگر جدا کرد. یکی از روش­های جداسازی اندامک­ها، جداسازی بر پایه تفاوت در اندازه و نرخ ته­نشینی اندامک­ها است که با روش سانتریفیوژ کردن افتراقی^[۴۱] انجام می­ شود (Lehninger, 2004). جداسازی میتوکندری در دو گامه­ی سانتریفیوژ انجام می­ شود. در گامه اول (سرعت پایین، g 1000-800) اندامک­های بزرگتر مانند هسته و لاشه سلول و در گامه دوم (سرعت بالا، g 15000-10000)، میتوکندری­ها ته­نشین می­شوند. البته ممکن است همراه با میتوکندری­ها، اندامک­های دیگری مانند گرانول­های تراوشی و کیسه­های گلژی (بیشتر در غدد درون‎ریز و برون­ریز) لایزوزوم­ها (در جگر، کلیه، طحال، لوکوسیت­ها و ماکروفاژها) و پراکسی‎زوم‎ها (بیشتر همراه با میتوکندری جدا شده از بافت جگر) نیز ته­نشین شوند که برای خالص­سازی میتوکندری، از سانتریفیوژ شیب غلظت^[۴۲] استفاده می­ شود (Pon and Schon, 2001). در بیشتر پژوهش­ها، برای بررسی میتوکندری­ سلول­های ماهیچه‎ای، تنها از سانتریفیوژ افتراقی، برای جداسازی استفاده شده است (Bottje et al., ۲۰۰۲). پیش­از انباشت میتوکندری، غشا­ی پلاسمایی و پیوندهای بین سلولی با­ روش آنزیمی (Protease K) Kolath, 2006)) و مکانیکی (همگن سازی نرم به کمک هموژنایزر با هاون تفلن) تخریب می‎شوند.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

در این آزمایش، جداسازی میتوکندری­ها از ماهیچه دو سر ران با­ روش کولاس Kolath, 2006)) و با اندکی تغییر انجام شد. به ازای هر نمونه، ۲۰ میلی­لیتر محلول I (100 میلی مولار Sucrose، ۱۰۰ میلی مولار Tris-HCl، ۴۶ میلی مولار KCl و ۱۰ میلی­مولار EDTA با ۴/۷= pH) تهیه شد. نمونه­های پنج گرمی گوشت از یخچال ^oC80- خارج و درون ۱۰ میلی لیتر محلول I سرد شده در یخ، انداخته شد. پس از یخ­گشایی، نمونه­ها با قیچی تکه تکه و برای پنج دقیقه درون ۵ میلی لیتر محلول I دارای ۵ میلی­گرم Protease K در دمای اتاق قرار داده شدند. محلول دارای نمونه برای دو دقیقه با هموژنایزر با هاون تفلن، همگن و برای ۵ دقیقه دیگر درون یخ نگهداری شد. سپس محلول همگن شده، به­درون میکروتیوب ۵/۱ میلی­لیتری ریخته شد و برای ۱۰ دقیقه در دور g1000 و دمای ۴ درجه سانتی ­گراد سانتریفیوژ شد (Sigma centrifuge, model: 1-15pk, UK). پلت تشکیل شده که دارای بقایا و لاشه سلول بود، دور ریخته شد و محلول باقی­مانده برای جداسازی میتوکندری­ها به مدت ۱۵ دقیقه در دور g 10,000 و دمای ۴ درجه سانتی ­گراد سانتریفیوژ شد. دراین فاصله زمانی، محلول شستشو (محلول I دارای ۵/۰ درصد BSA^[43]) آماده شد. در پایان گامه دوم سانتریفیوژ کردن، پلت تشکیل شده که دارای میتوکندری­ها بود نگه داشته شد و مایع رویی، دور­ریخته شد. پلت میتوکندری­ها، با یک میلی‎لیتر محلول شستشو و با پیپت کردن، شستشو شد و برای ته­نشین شدن دوباره میتوکندری­ها، برای ۱۵ دقیقه دیگر در دمای ۴ درجه سانتی گراد و دور g 10,000 سانتریفیوژ شد. در این مدت، به­ازای هر نمونه، ۲ میلی لیتر محلول II، (دارای ۲۳۰ میلی مولار Mannitol، ۷۰ میلی مولار Sucrose، ۲۰ میلی مولار Tris-HCl، ۵ میلی مولار KH₂PO₄ و با ۴/۷=pH) ساخته شد. پس­از آخرین گامه سانتریفیوژ، محلول رویی تخلیه و پلت بدون به­هم خوردن، با یک میلی لیتر از محلول II به آرامی شستشو شد. با پیپت کردن ۱ میلی­لیتر محلول II، میتوکندری­ها درون محلول به­ طور کامل معلق شدند. پس از مخلوط کردن کامل میتوکندری­ها درون محلول، ۵۰ میکرولیتر از محلول برای اندازه‎گیری غلظت میتوکندری به­ صورت جداگانه در دمای ۴ درجه سانتی ­گراد نگهداری شد و باقی­مانده نمونه­های میتوکندری، به سرعت در نیتروژن مایع منجمد و در دمای ^oC80- (فریزر ژال تجهیز، ایران) نگهداری شدند.
۳-۲-۲- اندازه ­گیری غلظت پروتین میتوکندریایی^[۴۴]
برای تعیین غلظت میتوکندری، غلظت پروتین، اندازه ­گیری می­ شود و به­ صورت غلظت پروتین میتوکندریایی بیان می­ شود. فعالیت آنزیمی، بر پایه مقدار پروتین میتوکندریایی (واحد/میلی گرم پروتین میتوکندریایی) محاسبه می­ شود Pon and Schon, 2001)).
روش Bradford یک روش رنگ سنجی برای اندازه ­گیری غلظت پروتین است که به‏سبب سادگی و حساسیت بالا، کاربرد زیادی دارد. اساس این روش، تغییر بیشینه جذب برای محلول اسیدی Coomassie blue G-250 از ۴۶۵ نانومتربه ۵۹۵ نانومتر هنگام پیوند یافتن با پروتین است. با افزایش غلظت پروتین، جذب نور در طول موج ۵۹۵ نانومتر به سبب افزایش پیوندهای بین پروتین و رنگ Coomassie blue G-250، افزایش می­یابد. برای تعیین همبستگی بین میزان جذب و غلظت پروتین، از غلظت­های استاندارد پروتین (بیشتر آلبومین سرم گاوی- BSA) استفاده می­ شود (Wenk and Fernandis, 2007).
در این آزمایش، اندازه ­گیری غلظت پروتین میتوکندریایی با روش Bradford و بر پایه رویه توضیح داده شده به­وسیله لارنس و داویس(Lawrence and Davies 1986) انجام شد. برای تهیه محلول Bradford، ۱۰ میلی گرم رنگ Coomassie blue G-250 در ۵ میلی لیتر اتانول ۹۵% به­ طور کامل حل شد. سپس، ۱۰ میلی لیتر فسفریک اسید ۸۵% به آن افزوده شد و پس از رساندن حجم به ۱۰۰ میلی لیتر، در دمای ۴ درجه سانتی گراد نگهداری شد. آلبومین سرم گاوی به­عنوان محلول پروتین استاندارد، به­کار برده شد. در آغاز، محلولی دارای یک میلی‎گرم BSA دریک میلی لیتر محلول II تهیه شد و سپس، به غلظت­های ۲۵/۰، ۵/۰، ۷۵/۰، ۱ و ۵/۱ میلی‎گرم در میلی لیتر آماده شدند. از هر غلظت پروتین استاندارد،۱۰ میکرولیتر به ۹۹۰ میکرولیتر محلول Bradford (که پیشاپیش با دمای اتاق، هم­دما شده بود) افزوده شد، با پیپت کردن به‏طور کامل مخلوط شد و ۵ دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد. در کیووت‎های پلاستیکی^[۴۵] و اسپکتروفتومتر (TECHNE – Specgene، آمریکا)، مقدار جذب نور در طول موج ۵۹۵ نانومتر (۲ تکرار) اندازه ­گیری شد. مقدار جذب نور در حضور نمونه­های دارای میتوکندری نیز با دوبار تکرار، اندازه ­گیری شد. اگر غلظت میتوکندری­ها بیشتر از بیشینه محلول استاندارد (۵/۱ میلی­گرم/میلی لیتر) بود، با افزودن حجمی برابر با حجم نمونه از محلول II، غلظت به نصف کاهش داده شد. سپس، معادله خط همبستگی میزان جذب نور و غلظت پروتین محاسبه و غلظت نمونه ها تعیین شد (نگاره ۳-۳).
نگاره ۳-۳: همبستگی مقدار جذب نور در طول موج ۵۹۵ نانومتر با غلظت پروتین.
۳-۲-۳- اندازه ­گیری فعالیت مجموعه­های آنزیمی زنجیره­ی تنفسی
فعالیت هر یک از مجموعه­های آنزیمی زنجیره تنفسی (Cox I-V) با روش بوهرس­نوتت (Bouhours-Nouetet al., ۲۰۰۵) و سندلاین(Sandelin, 2005) ، با اسپکتروفتومتر UV (TECHNE – Specgene) و در کیووت کوارتز، تغییر در جذب نور به­ سبب تغییر در غلظت سوبسترای ویژه هر یک از آنزیم­ها اندازه ­گیری شد. برای شکستن غشای میتوکندری، محلول دارای میتوکندری سه بار در نیتروژن مایع، یخ­زده شد و سپس یخ گشایی شد. اندازه ­گیری­ها، در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد و در حجم پایانی ۵۰۰ میکرولیتر و با دوبار تکرار برای هر نمونه، انجام شد. با بهره گرفتن از ضریب جذب، فعالیت هر یک از آنزیم­ها، کمی شده و به­ صورت واحد در میلی­گرم پروتین میتوکندریایی بیان شد.
۳-۲-۳-۱- اندازه ­گیری فعالیت مجموعه آنزیمی I (NADH – یوبی­کویی­نون اکسیدو ردوکتاز)
در زنجیره تنفسی، Complex I یک مجموعه آنزیم بزرگ با ۴۲ زنجیره پلی پپتیدی و دارای یک فلاووپروتین و حداقل شش مرکز آهن-سولفور است. الکترون به وسیله­ بازوی ماتریکسی Cox I از NADH گرفته شده و در بازوی درون غشایی به یوبی­کویی­نون^[۴۶] داده می‎شود (نگاره ۳-۴). روتنون^[۴۷] که یک ترکیب گیاهی است و به­ طور رایج به­عنوان حشره­کش مورد استفاده قرار می­گیرد، فعالیت Cox I را مهار می­ کند (Lehninger, 2004). به­سبب این­که برخی آنزیم‏ها مانند NADH: cytochorome b₅ reductase (یک آنزیم اکسید کننده NADH، چسبیده به غشای بیرونی میتوکندری و غیر حساس به روتنون)، فعالیت همانند­ی با Cox I دارند، ارزیابی فعالیت ویژه­ی Cox I، به­ صورت فعالیت حساس به روتنون^[۴۸] اندازه ­گیری می­ شود (Pon, 2001 Schon and).
نگاره ۳-۴: ساختار و کنش مجموعه­آنزیمی I زنجیره تنفسی(Lehninger, 2004).
اندازه ­گیری در چند گامه انجام شد:
الف) تهیه محلول­های KH₂PO₄ (۱۰۰ میلی­گرم در میلی­لیتر آب، ۵/۷=pH)، KCN (یک میلی­گرم در میلی­لیتر آب)، MgCl₂ (۱۰ میلی­گرم در میلی­لیتر آب)، Antimycin A (یک میلی­گرم در میلی­لیتر اتانول)، یوبی­کویی­نون ۲ (یک میلی­گرم در میلی­لیتر اتانول)، BSA (دو میلی­گرم در میلی­لیتر آب) NADH (یک میلی­گرم در میلی­لیتر اتانول) و Rotenone (یک میلی­گرم در میلی­لیتر اتانول).
ب) انکوباسیون ۱۰ تا ۲۰ میکرو­گرم پروتین میتوکندریایی (۱۰ میکرولیتر از محلول میتوکندری جداسازی شده) در ۲۴۰ میکرو­لیتر آب در دمای ۳۷ درجه سانتی ­گراد برای ۲ دقیقه درون کیووت کوارتز.
پ) افزودن محلول واکنشی شامل ۱۰ میلی­مولار KH₂PO₄، ۲/۵ میلی­مولار KCN، دو میکرو­گرم در میلی­لیتر Antimycin A، ۱۰۰ میکرومولار یوبی­کویی­نون ۲، یک میلی‎گرم در میلی‎لیتر BSA و ۲/۵ میلی­مولار MgCl₂، قرار دادن در دستگاه اسپکتروفتومتر و صفر کردن مقدار جذب نور در طول موج ۳۴۰ نانومتر.
ت) آغاز واکنش با افزودن ۲۰۰ میکرومولار NADH و مخلوط کردن کامل آن با محلول واکنشی به­وسیله پیپت کردن.
ث) خواندن مقدار جذب نور ۵ دقیقه پیش و پس از افزودن دو میکرو­گرم در میلی‎لیتر روتنون.
ج) محاسبه مقدار کاهش جذب نور ویژه­ی فعالیت Cox I، ضرب کردن آن در ضریب جذب mM^-1cm^-1 ۲۲/۶ برای محاسبه مقدار فعالیت آنزیم و تصحیح آن برای یک میلی‎گرم پروتین میتوکندریایی (معادله ۳-۱).
معادله ۳-۱
Cox I activity (U/mg Protein.)= {[(A-A’)]-[(A’-A” × (۶.۲۲×۱۰۰۰)]}/(C×۱۰)
A= NADH مقدار جذب نور در زمان افزودن
A’= مقدار جذب نور پیش از افزودن روتنون
A”= مقدار جذب نور پنج دقیقه پس از افزودن روتنون
C= غلظت میتوکندری (میلی­گرم پروتین در میلی­لیتر)
۳-۲-۳-۲- اندازه ­گیری فعالیت مجموعه آنزیمی II (سوکسینات دی­هیدروژناز^[۴۹])
کمپلکس II که به­نام­های سوکسینات دی­هیدروژناز و یا سوکسینات: یوبی­کویی­نون اکسیدوردوکتاز^[۵۰] نیز شناخته می­ شود، کوچکترین مجموعه آنزیمی زنجیره تنفسی (انتقال الکترون از FADH به یوبی­کویی­نون) و هم­چنین تنها آنزیم پیوند شده با غشا در چرخه کربس (تبدیل سوکسینات به فومارت) به­شمار می ­آید. این آنزیم دارای چهار زیر واحد پروتینی و سه هسته آهن- سولفور است (Lehninger, 2004) (نگاره ۳-۵). فعالیت این آنزیم به دو صورت فعالیت سوکسینات دی­هیدروژنازی و یا سوکسینات: ابی کویی نون اکسیدوردوکتازی اندازه‎گیری می‏شود. در روش نخست، تغییر جذب نور در طول موج ۶۰۰ نانومتر درپی احیا شدن ۲و۶ دی کلروفنول ایندوفنول^[۵۱] (DCPIP) با فنازین متوسولفات (PMS) شاخصی برای میزان فعالیت آنزیم است و در روش دوم، تغییرات جذب در همین طول موج درپی احیای ۲و۶ دی کلروفنول ایندوفنول با یوبی­کویی­نون ۲ اندازه گیری می­ شود. هر دو روش، برای اندازه ­گیری میزان فعالیت Complxe II مناسب است. شایان توجه است که، به سبب اثر مهارکنندگی اگزالواستات، بخشی از Complxe IIها نافعال می­شوند و برای اندازه ­گیری فعالیت این آنزیم به‎طور کامل، باید برای مدت کوتاهی با سوکسینات انکوباتور شود (Pon, 2001 Schon and).
نگاره ۳-۵: ساختار Complxe II زنجیره تنفسی میتوکندری (Scheffler, 2008).
در این آزمایش، فعالیت سوکسینات دی­هیدروژنازی Cox II اندازه ­گیری شد. پس از تهیه محلول­های آبی KH₂PO₄ (۱۰۰ میلی­گرم در میلی­لیتر، ۵/۷=pH)، Sodium succinate (100 میلی­گرم در میلی­لیتر)، KCN (یک میلی­گرم در میلی­لیتر)، PMS (یک میلی­گرم در میلی­لیتر) و DCPIP (یک میلی­گرم در میلی­لیتر)، آزمایش به ترتیب زیر انجام شد:
الف) مقدار ۱۰ تا ۲۰ میکروگرم پروتین میتوکندریایی (۱۰ میکرولیتر از محلول میتوکندری جداسازی شده) برای سه دقیقه درون محلول واکنشی شامل ۵۰ میلی مولار KH₂PO₄، ۱۶ میلی مولار Sodium succinate، ۵/۱ میلی مولار KCN و ۱۰۰ میکرومولار PMS در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد در انکوباتور نگهداری شد.
ب) دستگاه اسپکتروفتومتر برای طول موج ۶۰۰ نانومتر تنظیم و با محلول واکنشی دارای میتوکندری بلانک شد.
پ) مقدار ۱۰۰ میکرولیتر DCPIP به­محلول افزوده شد و پس از مخلوط کردن کامل آن به­وسیله پیپت کردن، مقدار جذب نور خوانده شده و در دمای ۳۷ درجه سانتی ­گراد نگهداری شد.
ت) پس از پنج دقیقه، دوباره جذب نور اندازه گیری و مقدار کاهش نور محاسبه شد.
ث) با بهره گرفتن از ضریب جذب mM^-1cm^-1 ۲۱ (Sandelin, 2005) و تصحیح برای یک میلی­گرم پروتین، مقدار فعالیت Cox II گزارش شد.
۳-۲-۳-۳- اندازه ­گیری فعالیت مجموعه آنزیمی III (یوبی­کویی­نول سایتوکروم c ردوکتاز)
یوبی­کویی­نون احیا شده (یوبی­کویی­نول^[۵۲]، QH₂) به­وسیله Cox I و Cox II، الکترون را به‎کمک Cox III به سایتوکروم c انتقال می­دهد. مجموعه آنزیمی III دارای ۱۱ زیر واحد پروتینی است که سه پروتین انتقال دهنده الکترون شامل سایتوکروم c₁، پروتین با هسته آهن-سولفور و سایتوکروم b را در­ بر دارند. سایتوکروم b از دو گروه هِم b_L و b_H (b₅₆₂ و b₅₆₆) تشکیل شده است. در دو گامه واکنش­های اکسایش و کاهشِ یک ملکول QH₂ (چرخه­ی Q)، دو ملکول سایتوکروم c₁ و در نتیجه دو ملکول سایتوکروم c احیا می­شوند و هم­زمان، چهار پروتون (H⁺) به فضای بین دو غشا فرستاده می­ شود (نگاره ۳-۶). آنتی مایسین A که فعالیت این مجموعه آنزیمی را مهار می‎کند، برای اندازه ­گیری احیا­ی غیر آنزیمی سایتوکروم c^[53] به­کار می رود (Pon, 2001 Schon and).
­
QH₂+Cyt c₁ (oxidized) → QH2+•Q^–+2H+N+Cyt c₁(oxidized)→
Q^– + ۲H⁺_P + Cyt c₁(reduced) QH2+2H+P+Cyt c₁ (reduced)
QH₂+2 cyt c₁(oxidized)+2H⁺_N→Q+2 cyt c₁ (reduced)+ 4 H⁺_P
نگاره ۳-۶: ساختار و کنش Cox III در زنجیره انتقال الکترون و چرخه Q (Lehninger, 2004).
در این آزمایش، ارزیابی فعالیت مجموعه­ آنزیمی III زنجیره­ی تنفسی در دو گامه انجام شد. گامه اول، شامل تهیه یوبی­کویی­نول ۲ از یوبی­کویی­نون ۲ بود و در گامه دوم، فعالیت آنزیم با اندازه ­گیری افزایش مقدار جذب نور در طول موج ۵۵۰ نانومتر در جریان اکسید شدن یوبی‎کویی­نول ۲ تعیین شد.
۳-۲-۳-۳-۱- احیا کردن یوبی­کویی­نون۲

۱۲/۸۳±۲/۴۸

۱۲/۷۵±۲/۴۶

جدول ۴-۲٫ مقاومت ورودی سلول در شرایط کنترل و ۱۰ دقیقه پس از کاربرد لینالول ۲/۰ میلی مولار.
۴-۳) ویژگی‌های پتانسیل عمل خودبخودی در حضور لینالول و مهار کننده‌های کانال‌های کلسیمی نیکل کلرید و نیفدیپین:
به منظور بررسی نقش کانال‌های کلسیمی در بروز تغییرات در الگوی فعالیت ناشی از لینالول ، به محفظه ثبت حاوی رینگر نرمال نیکل کلرید، مهار کننده غیر اختصاصی کانال‌های کلسیمی و نیفدیپین، مهار کننده کانال کلسیمی نوع L، افزوده شد و پاسخ سلول به لینالول پس از مهار کانال‌های کلسیمی بررسی شد. متعاقب بروز الگوی فعالیت burst در اثر لینالول، با افزودن NiCl (mM4) به محیط خارج سلولی کاهش تدریجی الگوی فعالیت burst در حدود ۳ دقیقه پس از کاربرد NiCl، رخ داد. در غالب موارد در کمتر از ۸ دقیقه پس از افزودن NiCl حذف تدریجی burst مشاهده می‌شد (شکل ۴-۵).
شکل ۴-۵٫ پس از بروز فعالیت burst در نتیجه­ افزودن لینالول ۲/۰ میلی مولار، NiCl به محفظه ثبت اضافه گردید. ۳ دقیقه پس از افزودن NiCl به محیط خارج سلولی کاهش الگوی burst مشاهده شد. ۸ دقیقه پس از افزودن NiCl حذف کامل الگوی burst قابل مشاهده است.
افزودن نیفدیپین (Nif) با غلظت μM40 به محفظه ثبت، بدنبال بروز فعالیت burst در اثر لیناول، منجر به کاهش الگوی burst در حدود ۴ دقیقه پس از کاربرد Nif شد در غالب موارد در حدود ۹ دقیقه پس از افزودن Nif الگوی فعالیت burst حذف شده و با اسپایک‌های منفرد جایگزین می‌شد. (شکل ۴-۶).
شکل ۴-۶٫ پس از بروز فعالیت burst در نتیجه افزودن لینالول ۲/۰ میلی مولار،Nif به محفظه­ ثبت اضافه گردید. ۴ دقیقه پس از افزودن Nifبه محیط خارج سلولی کاهش الگوی burst مشاهده شد. ۹ دقیقه پس از افزودن Nif حذف الگوی burst و برقراری اسپایک­های منفرد قابل مشاهده است.
۴-۴)ویژگی‌های پتانسیل عمل خودبخودی در حضور لینالول و مهار کننده‌های پروتئین­ کیناز­ها، H89 و کلریترین
به منظور بررسی نقش پروتئین کیناز­ها در بروز تغییرات در الگوی فعالیت ناشی از لینالول ، به محفظه ی ثبت حاوی رینگر نرمال H89، مهار کننده اختصاصی پروتئین کیناز وابسته به cAMP و کلریترین، مهار کننده اختصاصی پروتئین کیناز c، افزوده شد و پاسخ سلول به لینالول پس از مهار این پروتئین کیناز­ها بررسی شد.
متعاقب بروز الگوی فعالیت burst در اثر لینالول، با افزودن (μM66) H89 به محیط خارج سلولی تعدیل تدریجی الگوی فعالیت burst در حدود ۷ دقیقه پس از کاربرد H89، رخ داد. در غالب موارد در کمتر از ۱۵ دقیقه پس از افزودن H89الگوی فعالیت burst بتدریج حذف شده و با اسپایک‌های منفرد جایگزین می‌شد (شکل ۴-۷).
شکل ۴-۷٫ پس از بروز فعالیت burst در نتیجه­ افزودن لینالول ۲/۰ میلی مولار،H89 به محفظه­ ثبت اضافه گردید. ۷ دقیقه پس از افزودن H89به محیط خارج سلولی تعدیل الگوی burst مشاهده شد. ۱۵ دقیقه پس از افزودن H89 حذف الگوی burst و برقراری اسپایک­های منفرد قابل مشاهده است.
افزودن کلریترین (chelerythrine) با غلظت μM)13) به محفظه­ ثبت، بدنبال بروز فعالیت burst در اثر لیناول، منجر به کاهش الگوی burst درکمتر از ۵ دقیقه پس از کاربرد کلریترین شد در غالب موارد در حدود ۱۲ دقیقه پس از افزودن کلریترین الگوی فعالیت burst حذف شده و با اسپایک‌های منفرد جایگزین می‌شد (شکل ۴-۸).
شکل ۴-۸٫ پس از بروز فعالیت burst در نتیجه­ افزودن لینالول ۲/۰ میلی مولار، به محفظه­ ثبت اضافه گردید.دقیقه پس از افزودن chelerythrineبه محیط خارج سلولی کاهش الگوی burst مشاهده شد. ۱۲ دقیقه پس از افزودن chelerythrine حذف الگوی burst و برقراری اسپایک­های منفرد قابل مشاهده است.
فصل پنجم
بحث و نتیجه ­گیری
۵) بحث و نتیجه ­گیری
۵-۱) بحث
نتایج تحقیق حاضر نشان داد که لینالول فعالیت الکتریکی سلول‌های عصبی حلزون را افزایش می­دهد. همچنین مطالعه‌ ویژگی‌های اسپایک‌ها در حضور لینالول نشان داد بسیاری از تغییرات اعمال شده در الگوی فعالیت نورون‌های حلزون توسط لینالول، از تغییرات ایجاد شده در جریانات غشایی سلول‌ها بویژه جریانات کلسیمی، پتاسیمی وابسته به ولتاژ و پتاسیمی وابسته به کلسیم و همچنین مسیرهای فسفریلاسیون پروتئین کیناز­ها حاصل می‌شود.
۵-۱-۱) تغییر در ویژگی‌های پتانسیل عمل در حضور لینالول
در حضور غلظت mM1/0 لینالول، دامنه اسپایک‌های سدیمی کاهش معنی‌دار را نشان داد. در رینگر نرمال جریانات سدیمی رو به داخل که با دپلاریزاسیون غشا تا حد آستانه و باز شدن کانال‌های سدیمی فعال می‌شوند، عامل اصلی فاز بالارو پتانسیل عمل هستند. بااینحال دپولاریزاسیون آهسته و طولانی مدت غشاء باعث می­ شود تعدادی از کانالهای سدیمی پس از فعال شدن اولیه، غیرفعال شده و در همین وضعیت باقی بمانند. این وضعیت می ­تواند تعداد کانالهای سدیمی که عملاً در پتانسیل عمل مشارکت می­ کنند را کاهش داده و باعث کاهش دامنه پتانسیل عمل گردد. با توجه به کاهش قابل توجه در دامنه اسپایک­های سدیمی در حضور لینالول ۱/۰ میلی مولار طی ۵ تا ۱۰ دقیقه از زمان مجاورت با لینالول به نظر می­رسد این تاثیر نتیجه دپلاریزاسیون تاخیری و آهسته غشاء باشد و نه مهار مستقیم کانالهای سدیمی زیرا با تزریق جریان مستقیم و برگرداندن ولتاژ استراحت به حدود شرایط کنترل کاهش دامنه پتانسیل­های عمل بطور قابل توجهی جبران ­گردید.
کاهش در دامنه و مدت AHP در حضور لینالول، کانال‌های پتاسیمی موثر در بروز AHP یعنی کانال‌های پتاسیمی وابسته به ولتاژ نوع جبران کننده‌ی تاخیری و هر دو نوع کانال‌های پتاسیمی وابسته به کلسیم را بعنوان اهداف اثر لینالول مطرح می‌کند. حداقل سه جریان پتاسیمی در نورون‌های حلزون شناسایی شده است که شامل جریان پتاسیمی سریع غیر فعال شونده (نوع A)، جریان پتاسیمی وابسته به کلسیم و جریان پتاسیمی جبران کننده‌ تاخیری می‌باشند. در حالیکه نوع اول به۴-AP^[52] حساس است، نوع وابسته به کلسیم به TEA داخل سلولی حساس می‌باشد (Thompson, 1977; Bukanova, et al., 2002; Staras, et al., 2002). در بسیاری از نورون‌های مهره‌داران و بی‌مهرگان از جمله نورون‌های حلزون فاز رپلاریزاسیون پتانسیل عمل و پتانسیل متعاقب هیپرپلاریزاسیون توسط فعالیت کانال‌های پتاسیمی وابسته به ولتاژ بویژه نوع جبران کننده‌ تاخیری (Silva, et al., 1990) و وابسته به غلظت کلسیم سیتوزلی، BK و SK، تعیین می‌شوند و فعالیت کانال‌های پتاسیمی وابسته به کلسیم اساسا در شکل و فرکانس و نیز الگوی شلیک پتانسیل عمل نقش دارند (Gola, et al., 1990; Faber and Sah, 2003). مهار کانال‌های K_Dr توسط تترا اتیل آمونیوم و کوکائین منجر به کاهش قابل توجه دامنه فاز رپلاریزاسیون پتانسیل عمل در نورون‌های حلزون و بروز فعالیت انفجاری می‌شود (Chen et al., 2006). بررسی‌های قبلی نشان داده که کانال‌های پتاسیمی وابسته به کلسیم نوع SK توسط پپتید مستخرج از سم زنبور عسل یعنی ایپمین، مهار و موجب کاهش دامنه و طول مدت AHP پتانسیل عمل می‌شود (Vatanparast and Janahmadi., 2009). از آنجائیکه AHP یک عامل اساسی تعیین کننده در میزان فعالیت نورون‌هاست، کاهش آن افزایش فرکانس اسپایک‌ها را در پی دارد. در بسیاری از نورون‌ها از جمله نورون‌های حلزون، کانال‌های پتاسیمی وابسته به کلسیم نقش اصلی را در ایجاد AHP و تنظیم فرکانس اسپایک‌ها بر عهده دارند، تغییر در عملکرد این نوع کانال‌‌های پتاسیمی، که موجب تغییر در دامنه و مدتAHP می‌شود، می‌تواند تحریک‌پذیری نورونی و آستانه القایی فرایندهای فیزیولوژیک وابسته به کلسیم را تغییر دهد (Sah et al., 1992; Kumer and Foster, 2002; Faber and Sah, 2003;Lin et al., 2010). در بررسی حاضر نیز دامنه و مدتAHP تحت تاثیر غلظت ۱/۰میلی مولار لینالول کاهش یافت. احتمالا لینالول بواسطه تاثیر مهاری بر کانال‌های پتاسیمی نوع جبران کننده‌ تاخیری و کانال‌های پتاسیمی وابسته به کلسیم منجر به کاهش دامنه و مدت AHP و در نتیجه افزایش تحریک‌پذیری نورونی شده است. از طرفی با توجه به گزارش­های متعدد مبنی بر رابطه­ معکوس بین فرکانس پتانسیل عمل و مدت زمان AHP (Hallworth et al., 2003; Vatanparast et al., 2007) بخشی از افزایش فرکانس مشاهده شده در حضور لینالول ۱/۰ میلی مولار را می­توان به مدت زمان کاهش یافته­ AHP نسبت داد. بدنبال کاربرد لینالول ۱/۰ میلی مولار یک دپلاریزاسیون آهسته در پتانسیل استراحت غشاء ایجاد گردید. مثبت­تر شدن پتانسیل غشاء خود می ­تواند توجیهی برای افزایش فرکانس اسپایک­ها پس از بکارگیری لینالول باشد. از آنجاییکه کانال‌های پتاسیمی فعال شونده توسط کلسیم نقش مهمی در کنترل پتانسیل غشا بازی می‌کنند، فعال شدن این کانال‌ها موجب هیپرپلاریزه شدن و مهار آن‌ها دپلاریزاسیون غشا را در پی دارد (Zhang et al., 2003; Dilly, et al., 2005; Yazdi et al.,2007). دپولاریزاسیون آهسته غشاء تحت تاثیر لینالول می‌تواند از مهار نسبی کانالهای پتاسیمی وابسته به کلسیم نتیجه شده باشد که به نوبه خود می‌تواند بر تحریک پذیری سلولی تاثیر بگذارد.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

در روند رپلاریزاسیون پتانسیل غشا، انواعی از کانال‌های پتاسیمی وابسته به ولتاژ (بویژه نوع K_Dr) و کانال‌های پتاسیمی وابسته به کلسیم، BK و SK، مشارکت دارند. هر دو گروه عمده کانال‌های پتاسیمی وابسته به کلسیم، BK و SK، در نورون‌های حلزون شناسایی شده‌اند (Gola, et al., 1990; Bal, et al., 2001). فعالیت کانال‌های پتاسیمی وابسته به کلسیم در شکل و الگوی شلیک پتانسیل عمل نقش مهمی دارند. کانال‌های BK وابسته به ولتاژ غشاء و غلظت کلسیم درون سلولی هستند و قابلیت هدایت بالایی دارند. این کانال‌ها بخاطر کنتیک سریع در فاز رپلاریزاسیون پتانسیل عمل نیز شرکت دارند. درحالیکه کانال‌های SK وابسته به ولتاژ غشا نبوده و تنها به غلظت کلسیم وابسته هستند و در رپلاریزاسیون پتانسیل عمل سهیم نیستند ولی در فرکانس‌های بالا شدیدا فعال شده و بعنوان یک عامل بازدارنده قوی firing عمل می‌کنند (Sah,1996., Bal, et al., 2001;Faber and Sah, 2003). کانال‌های BK بوسیله پاکسیلین^[۵۳] مهار می‌شوند، درحالیکه کانال‌های SK توسط ایپیمین مهار می‌شوند (Crest and Gola, 1993).
در حضور لینالول ۱/۰ و ۲/۰میلی مولار شیب فاز دپلاریزاسیون و رپلاریزاسیون پتانسیل عمل کاهش معنی‌داری را نشان داد. با توجه به نقش کانال‌های سدیمی در ایجاد فاز دپلاریزاسیون، احتمالا غیرفعال شدن تعدادی از کانالهای سدیمی در نتیجه دپلاریزاسیون نسبی غشاء در کاهش شیب و دامنه فاز بالارو پتانسیل عمل نقش دارد. از طرفی کاهش در شیب فاز رپلاریزاسیون پتانسیل عمل احتمالا در نتیجه اثر مهاری لینالول بر روی کانال‌های پتاسیمی دخیل در فاز رپلاریزاسیون، بویژه نوع جبران کننده تاخیری و BK، می‌باشد. افزایش طول مدت اسپایک‌ها در حضور لینالول را می‌توان در نتیجه اثر مهاری لینالول بر کانال‌های دخیل در فاز رپلاریزاسیون و کاهش شیب فاز رپلاریزاسیون توجیه کرد.
۵-۱-۲) تغییر در فعالیت نورونی و بروز الگوی burst در حضور لینالول
در حضور غلظت­ ۲/۰ میلی مولار لینالول الگوی کلی فعالیت از فرم منظم به الگوی burst تغییر یافت. تا کنون نقش انواعی از جریان­های یونی در بروز الگوی burst در نورون­های حلزون بررسی شده است. که از آن میان می­توان به مهار کانال­های پتاسیمی وابسته به کلسیم و K_Dr اشاره کرد(Crest and Gola, 1993; Pedarzani et al., 2001; Hallworth et al., 2003; Chen and Tsia 2006). کانال‌های پتاسیمی نوع K_Dr که در روند رپلاریزاسیون پتانسیل عمل شرکت دارند نیز جهت حفظ الگوی منظم ضروری هستند، مهار این کانال‌ها توسط آمفتامین (Chen and Tsia 2000)، تترااتیل­آمونیوم و کوکائین (Chen and Tsia, 2006) در افزایش تحریک‌پذیری سلول و بروز الگوی burst نشان داده شده است. مهار K_Dr برای ایجاد فعالیت burst در نورون لازم می‌باشد (Chen et al., 2006). در بسیاری از نورون­ها کانال­های پتاسیمی وابسته به کلسیم بویژه نوع SK برای حفظ الگوی اسپایک‌های منفرد و منظم ضروری هستند و فعالیت آن‌ها مانع از افزایش بیش از حد فرکانس و بروز الگوی burst می‌گردد در حالیکه مهار آن‌ها باعث اختلال و ناهماهنگی در الگوی فعالیت منظم شده و نورون را مستعد بروز فعالیت burst می‌کند (Crest and Gola, 1993; Pedarzani et al., 2001; Hallworth, 2003).
بنابراین با توجه به نتایج این بخش از مطالعه­ ما احتمالاً کاهش فعالیت کانال‌های پتاسیمی وابسته به کلسیم و کانال‌های پتاسیمی نوع جبران کننده‌ تاخیری در حضور غلظت ۲/۰ میلی مولار لینالول در اختلال الگوی طبیعی و منظم اسپایک‌های سدیمی موثر است. شواهد بدست آمده در این تحقیق حذف الگوی burst در حضور مهارکننده­های کانال­های کلسیمی حضور جریانات کلسیمی در شرایط بروز فعالیت انفجاری در حضور لینالول را تایید می­ کنند.
طی مطالعات صورت گرفته مشخص شده است که غشاء نورون­های حلزون تراکم نسبتاٌ بالایی از کانال­های کلسیمی خصوصاٌ نوع L و T دارند. به گونه ­ای که کانال­های کلسیمی موجود در جسم سلولی نورون­های حلزون حتی به منظور ایجاد پتانسیل­ عمل­های کلسیمی، در غیاب ورود سدیم، کافی می­باشد (Chamberlain and Kekut., 1969; Vatanparast et al., 2006). کاربرد نیکل کلرید (مهارکننده­ غیراختصاصی کانال­های کلسیمی با تاثیر عمده بر کانالهای کلسیمی نوع T) بدنبال بروز الگوی burst حاصل از بکارگیری غلظت ۲/۰ میلی مولار لینالول، در همه­ موارد منجر به حذف کامل الگوی burst و در نهایت حدف کامل فعالیت خودبه­خودی نورون شد. بکارگیری نیفدیپین (مهارکننده­ اختصاصی کانال­های کلسیمی نوع L) با کاهش شدت الگوی burst و در نهایت با حذف این الگو همراه بود. با توجه به شواهد موجود می­توان بیان کرد که علاوه بر حضور جریانهای کلسیمی در شرایط القاء فعالیت انفجاری در حضور لینالول، احتمالاً این ترکیب تقویت جریانهای مذکور را نیز باعث می­ شود. با توجه به اینکه ورود کلسیم طی پتانسیل عمل عمدتاً در فاز رپلاریزاسیون رخ می­دهد (Llinas et al.,1981) مهار کانال­های پتاسیمی علاوه بر اثر مستقیمی که در افزایش تحریک­پذیری دارد، بواسطه­ تأثیرش در جهت افزایش طول مدت فاز رپلاریزاسیون بطور غیر مستقیم باعث افزایش ورود کلسیم و بنابراین تشدید تحریک­پذیری می­شوند. بنابراین می­توان اثرات افزاینده­ غلظت ۲/۰ میلی مولار لینالول بر تحریک­پذیری را تا حد زیادی به اثرات مهاری­اش بر کانال­های پتاسیمی نسبت داد.
همچنین بر اساس نتیجه تحقیق حاضر کاربرد H89 (مهارکننده­ پروتئین کینازA) و کلریترین (مهارکننده­ پروتئین کینازC) بدنبال بروز الگوی burst حاصل از بکارگیری غلظت ۲/۰ میلی مولار لینالول، در همه­ موارد منجر به حذف کامل الگوی burst و جایگزینی اسپایک­های سدیمی منظم شد، که نشان دهنده­ مشارکت پروتئین کینازها در اثرات اعمال شده­ توسط لینالول ۲/۰ میلی مولار می­باشد. فسفریلاسیون کانال­های کلسیمی HVA توسط PKA یا PKC منجر به افزایش­ جریان­های کلسیمی در سلول­های تحریک­پذیر می­ شود (Yang and Tsien, 1993). PKA و PKC جریانات A-type را در نورون­های شاخ پشتی نخاع کاهش می­ دهند (Hu et al., 2003) و هم­چنین فعال سازی PKC در نورون­های هیپوکمپ باعث مهار جریان­های پتاسیمی مداوم، که شامل جریان­های پتاسیمی وابسته به کلسیم یا I_K-Ca و غیر وابسته به کلسیم I_K می­ شود (Doerner et al., 1988). بنابراین محتمل است که PKA و PKC از طریق مهار کانال­های پتاسیمی باعث افزایش تحریک‌پذیری سلول می­شوند و در بروز الگوی burst مشارکت می­ کنند. بنظر می­رسد لینالول علاوه بر تاثیر مستقیم می ­تواند بطور غیر­مستقیم از طریق پروتئین کینازها، باعث فسفریله شدن کانال­های یونی ­شود در نتیجه فعالیت آنها را تعدیل کند.
۵-۲) نتیجه‌گیری
با توجه به تغییر در الگوی فعالیت نورونی و اثرات افزایشی فعالیت نورون‌ها در حضور غلظت‌های ۱/۰ و ۲/۰ لینالول، نتایج تحقیق حاضر تایید کننده اثر‌گذاری لینالول بر فعالیت الکتریکی سلول‌ها بواسطه‌ تاثیر بر فعالیت کانال‌های یونی بویژه کانال‌های پتاسیمی جبران کننده تاخیری و حساس به کلسیم، کانال‌های کلسیمی وابسته به ولتاژ و مسیرهای فسفریلاسیون پروتئین کینازها است. نتایج این تحقیق با تائید صرع زایی لینالول در شرایط تاثیر مستقیم بر سلول با یافته های برخی محققان در تائید اثرات ضد صرع این ترکیب در مهره داران در تناقض است. شرایط تجویز سیستمیک در نمونه های مهره دار و نیز تفاوت در ویژگیهای غشاء در مدل سلولی می تواند در تفاوت مشاهده شده نقش داشته باشد که تائید آن به مطالعات بیشتر نیاز دارد. بر این اساس می‌توان بسیاری از اثرات تحریکی اسانس‌های گیاهی حاوی لینالول بر فعالیت الکتریکی سلول‌ها را ناشی از تاثیر این ماده بر عملکرد کانال‌های کلسیمی و پتاسیمی دانست.
۵-۳) پیشنهادات برای مطالعات آینده
۱- انجام آزمایشات ولتاژ کلمپ به منظور تعیین دقیق اثرات لینالول بر هدایت کانال‌های یونی.
۲- انجام آزمایشات بر روی نورون‌های ایزوله (در محیط کشت) یا در حضور مهارکننده‌های گیرنده‌های سیناپسی.
۳- استفاده از بلوکرهای اختصاصی کانال‌های یونی جهت تفکیک اثرات لینالول بر هر یک از کانال‌ها به تنهایی و انجام آزمایشات ولتاژ کلمپ.
۴- انجام آزمایش بر برش­های مغزی موش صحرایی و سایر مهره­داران
فهرست منابع و ماخذ
Altrup, U., Ha dera, M., Storzb, U. (2003). Endogenous pacemaker potentials develop into paroxysmal depolarization shifts (PDSs) with application of an epileptogenic drug. Brain Res. 975, 73–۸۴٫
Bakkali, F., Averbeck, S., Averbeck, D., Idaomar, M. (2008). Biological effects of essential oils – A review. Food Chem. Toxicol. 46, 446–۴۷۵٫
Bal, R., Janahmadi, M., Green, G.G.R., Sanders. D.J. (2001).Two kinds of transient outward currents, IA and IAdepol, in F76 and D1 soma membranes of the subesophageal ganglia of Helix aspersa. J. Membr. Biol. 179, 71-78.
Batista, P.A., Werner, M.F., Oliveira, E.C., Burgos, L., Pereira, P., Brum, L.F., Story, G.M., Santos, A.R. (2010). The antinociceptive effect of (-)-linalool in models of chronic inflammatory and neuropathic hypersensitivity in mice. J. Pain. 11: 1222-1229.
Blagden, S., de Bono, J. (2005). Drugging cell cycle kinases in cancer therapy Curr. Drug Targets. 6, 325-335.
Braun, L., Cohen, M. (2007). Herbs and Natural Supplements: An Evidence-based Guide. Second ed, Australia, ISBN: 072953796X.
Buchbauer, G., Jirovetz, L., Jager, W., Dietrich, H., Plank, C. (1991). Aromatherapy: evidence for sedative effects of the essential oil of lavender after inhalation. Z Naturforsch [C]. 46, 1067–۱۰۷۲٫
Burkey, J.L., Sauer, J.M., McQueen, C.A., Sipes, I.G. (2000).Cytotoxicity and genotoxicity of methyleugenol and related congeners – a mechanism of activation for methyleugenol.Mutat. Res. 453, 25–۳۳٫
Burkhard, P.R., Burkhardt, K., Haenggeli, C.A., Landis, T. (1999). Plant-induced seizures: reappearance of an old problem. J. Neurol. 246, 667-670.

(کلرید سدیم) ۱ گرم + (سولفات کلسیم) ۰۵/۱ گرم

محلول شماره ۶

EC=3 dS/m , SAR= 12 (meq/L)^1/2

(کلرید سدیم) ۱/۱ گرم+ (سولفات کلسیم) ۵۵/. گرم

محلول شماره ۷

EC=5 dS/m , SAR= 9 (meq/L)^1/2

(کلرید سدیم) ۶۳/۱ گرم + (سولفات کلسیم) گرم ۴/۲

محلول شماره ۸

EC=5 dS/m , SAR= 12 (meq/L)^1/2

(کلرید سدیم) گرم۸/۱ + (سولفات کلسیم) گرم۶/۱

۲-۴– آماده کردن استوانه های اندازه گیری کننده هدایت هیدرولیکی اشباع
بعد از بدست آوردن فرمول تهیه محلول ها برای شروع آزمایش، ابتدا حجم استوانه ها از جنس پلاستیک شفاف بقطر ۳۴/۱۸ سانتیمتر و ارتفاع ۲۱سانتیمتر بوسیله درپوشی که دارای استوانه مدرج بوده و از کف بوسیله یک صحفه مشبک مسدود شده بود را محاسبه کردیم. با توجه به وزن مخصوص ظاهری محاسبه شده نمونه خاکها و حجم استوانه ها، وزن خاک که باید داخل استوانه ها تا ارتفاع ۲۴ سانتی متری ریخته می شد محاسبه، سپس روی صحفه مشبک برای جلو گیری از خروج رسها به ضخامت ۳ سانتیمتر کوارتز به قطر ۹۰ میکرون ریخته، نمونه خاک را بعد از هوا خشک کردن و عبور دادن از الک ۱۰ میلیمتری به ارتفاع ۲۱ سانتی متر بر روی کوارتز ریخته، درپوش بر روی استوانه قرار داده، بوسیله چسب آکواریوم کاملاً آبندی شد.

( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

H₁
H₂
cm 24
شکل (۲-۱): سیستم بار افتان برای اندازه گیری هدایت هیدرولیکی اشباع
۲-۵- اندازه گیری هدایت هیدرولیکی اشباع خاک
آزمایش را با محلول شماره ۸ که دارای بالاترین شوری ۵ (دسی زیمنس بر متر) و پایین ترین نسبت جذبی سدیم ۹ (ریشه میلی اکی والان در لیتر) را داشت (برای جلوگیری از پراکنده شدن خاک) شروع نموده و برای اشباع شدن خاک، استوانه را بمدت ۲۴ ساعت داخل اولین محلول (محلول شماره ۸) قرار داده، بعد از ۲۴ ساعت استوانه را از محلول در آورده، سپس استوانه مدرج بالای نمونه را با اولین محلول پر نموده اجازه داده شد تا محلول کاملاً داخل خاک نفوذ کرده و از پایین استوانه خارج شود و در ضمن باید دقت می شد که محلول از تمام حجم خاک عبور می کرد. سپس استوانه مدرج بالای درپوش را دو سه بار پر نموده و اجازه داده شد که محلول از سطح خاک نفوذ و از انتهای استوانه خارج می شد. بعد از اینکه آهنگ نفوذ ثابت شد دوباره استوانه را پر کرده و اجازه داده شد تا آب نفوذ کند بمحض رسیدن محلول تا سطح ‌H₁ زمان گرفته شد(t₁). زمان کاهش ارتفاع آب درون استوانه و رسیدن سطح محلول به H₂ ثبت شد(t₂).
برای هر محلول آزمایش سه بار تکرار، و نتایج در جداولی در برنامه اکسل جهت تجزیه و تحلیل داده ها ثبت شدند. بعد ازاتمام اولین محلول و قبل از شروع با محلول بعدی، استوانه بالای درپوش را با محلول بعدی پر، و اجازه داده شد که محلول داخل نمونه خاک کاملاً آبشویی شده و دوسه بار اینکار تکرار و بعد از ثبیت شدن زمان نفوذ، آزمایش را شروع کردیم. برای هر نمونه خاک ۸ تیمار با سه تکرار بعلاوه ۳ نمونه شاهد جمعاً برای هر نمونه ۲۷ آزمایش در قالب طرح فاکتوریل بر پایه طرح کاملاً تصادفی انجام و نتایج ثبت گردید. سپس با بهره گرفتن از فرمول زیر مقدار هدایت هیدرولیکی اشباع محاسبه گردید.

۲-۶- روش تجزیه و تحلیل آماری
بعد از محاسبه Ks نتایج در نرم افزار اکسل مرتب وجهت آنالیز داده ها از نرم افزارSPSS18 استفاده شد. همچنین مدلهای رگرسیونی ارائه شده توسط نرم افزار که برای پیش بینی کردن اثرات متقابل شوری و نسبت جذبی سدیم بر هدایت هیدرولیکی اشباع بایستی ارزیابی می شدند. هدف از ارزیابی مدل ها بررسی کارایی مدل و دقت مدل در شبیه سازی واقعیت است امکان ندارد که یک مدل همان دادهای واقعی را شیبه سازی کند. برای ارزیابی مدل بایستی داده های مدل که داده های شبیه سازی شده (پیش بینی شده) نامیده می شود با داده های واقعی که داده های مشاهداتی (اندازه گیری شده) نامیده می شود، مقایسه نمود و دقت مدل در شبیه سازی را تخمین زد. برای این منظور ازروشهای زیر استفاده گردید.
۲-۶-۱- جذر میانگین مربعات خطا(RMSE) ^[۵۲]

: داده های شبیه سازی شدهp_i
داده های مشاهداتی : o_i
۲-۶-۲- خطای میانگین مطلق^[۵۳](MAE)

این فرمول میانگین اختلاف دادهای واقعی با شبیه سازی شده را نشان می دهد و حداقلش مساوی صفر است.
۲-۶-۳- خطای نسبی ^[۵۴](RE)

نشان دهنده درصد خطای داه های شبیه سازی شده نسبت به داده های واقعی می باشد.
Ō : میانگین داده های مشاهداتی
فصل سوم: نتایج و بحث
۳-۱- تأثیر هدایت الکتریکی و نسبت جذبی سدیم بر هدایت هیدرولیکی اشباع در خاک لومی شنی
نتایج حاصل از جدول تجزیه واریانس (۳-۱) نشان می دهد تأثیر شوری و نسبت جذبی سدیم آب آبیاری بر هدایت هیدرولیکی اشباع خاک با بافت لومی شنی در سطح ۱ درصد معنی دار می باشد.
جدول(۳-۱): تجزیه ی واریانس تأثیر شوری و نسبت جذبی سدیم بر هدایت هیدرولیکی اشباع در خاک لومی شنی