چند ریختی AluI با جایگزینی باز گوانین با آدنین ایجاد می­ شود و در­پی آن در گیرنده­ی هورمون رشد، اسید آمینه­ی سرین جایگزین گلایسین می­ شود. این تغییر دو آلل A و G ایجاد می­ کند. دای­اس تاسیو و همکاران (Di Stasio et al., 2005) گزراش کردند که چند ریختی AluI در اگزون ۱۰ با صفت افت وزن در گوشت^[۲۱] گوساله­های نژاد پایمانتیز^[۲۲] رابطه معنی دار دارد. اولنسکی و همکاران (Oleński et al., 2010) گزارش کردند که چندریختی AluI در اگزون ۱۰ با صفات تولید شیر و ترکیبات آن در گاوهای شیری و ارزش اصلاحی گاوهای نر همراهی معنی دار دارد. آلل A برچربی و پروتئین و آلل G بر مقدار تولید شیر موثر بود. کواکس و همکاران (Kovacs et al., 2006) گزارش کردند که چندریختی AluI در اگزون ۱۰ با تولید شیر و فاصله­ی زایش در گاو­های هلشتاین همراهی معنی دار ندارد. هاردکا و همکاران (Hradecká et al., 2008) با بررسی چند شکلی AluI در اگزون ۱۰ گزارش کردند که فراوانی آلل A در نژاد هلشتاین۱/۹۵ درصد است. بین این چندریختی و ارزش اصلاحی چربی شیر همراهی معنی­دار وجود دارد و گاوهای دارای ژنوتیپ GG ارزش اصلاحی کمتری برای چربی شیر نسبت به گاوهایی با ژنوتیپ AA بودند.

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

فصل سوم
مواد و روش­ها
۳-۱- محل اجرای پژوهش
این پژوهش با همکاری دو واحد پرورش گاو شیری هلشتاین در استان فارس انجام شد. در این پژوهش، از ۱۳۰ گاو شیری که دست­کم برای یک دوره­ شیردهی رکورد تولیدی و تولید مثلی داشتند، با بهره گرفتن از ونوجکت­های دارایEDTA^[23] خونگیری شد. نمونه­ها درون یخ قرار داده شدند و در آزمایشگاه مرکزی دانشکده دامپزشکی دانشگاه شیراز، در دمای منفی ۲۰ درجه­ سانتی ­گراد نگهداری شدند. همه فرایند­های آزمایشگاهی در آزمایشگاه مرکزی دانشکده­ی دامپزشکی انجام شد.
۳-۲- استخراج DNA
استخراج DNA ژنومیک با بهره گرفتن از کیت استخراج DNA شرکت ژن فناوران در چند گامه انجام شد:
۱-۱۰۰ میکرولیتر از نمونه­ خون در داخل میکروتیوب­های ۵/۱ میلی­لیتر­ی ریخته شد.
۲-۴۰۰ میکرولیتر ماده­ Lysis Reagent به هر نمونه افزوده شد، نمونه­ها به هم زده شدند تا در ته میکروتیوب­ها رسوب دیده شود.
۳- نمونه­ها به مدت ۵ دقیقه در داخل انکوباتور با حرارت ۶۵ درجه سانتی ­گراد قرار داده شد.
۴- نمونه­ها از انکوباتور خارج شدند، و ۲۰ میکرولیتر ماده جذب کننده­ Nuclease به هرنمونه افزوده شد، و به مدت ۱۰ دقیقه به­هم زده شدند.
۵- به مدت ۱۰ ثانیه و در سرعت g 5000 نمونه­ها سانتریفیوژ شدند، و سپس مایع بالایی آنها دور ریخته شد.
۶-۲۰۰ میکرولیتر ماده Lysis Reagent به رسوب سفید رنگ ته میکروتیوب­ها افزوده شد، و با ورتکس محیط یکسانی حاصل شدند.
۷- به محیط همگن شده، ۴۰۰ میکرولیتر Saline Buffer افزوده شد و نمونه­ها چند بار بالا و پایین شدند.
۸- نمونه­ها به مدت ۱۰ ثانیه در سرعت g 5000 سانتریفیوژ شدند، و سپس مایع بالایی آنها دور ریخته شدند.
۹- ۵۰۰ میکرولیتر Saline Buffer به رسوب سفید رنگ ته میکروتیوب­ها افزوده شد، و با ورتکس محیط یکسانی حاصل شد.
۱۰- نمونه­ها به مدت ۱۰ ثانیه در سرعتg 5000 سانتریفیوژ شدند.
۱۱- میکروتیوب­ها به مدت ۱۰ دقیقه به صورت درب­باز در انکوباتور با درجه­ حرارت ۶۵ درجه قرار داده شدند.
۱۲- بعد از خارج کردن نمونه­ها از انکوباتور در صورتی که بوی الکل نداشت، ۸۰ میکرولیتر Extra Gene E به هر نمونه اضافه شد و با ورتکس مخلوطی همگن حاصل شد.
۱۳ – نمونه­ها، به مدت ۱۰ دقیقه، در انکوباتور با دمای ۶۵ درجه سانتیگراد قرار گرفتند.
۱۴- بعد از خارج کردن نمونه­ها از انکوباتور، با ورتکس محیط همگن شدند.
۱۵- نمونه­ها به مدت ۲ دقیقه با سرعت g 10000 سانتریفیوژ شدند.
۱۶- بخش بالایی میکروتیوب­ها که دارای DNA بود، به میکروتیوب­های جدید منتقل شد و در دمای منفی ۲۰ درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
۳-۳- بررسی کمیت و کیفیت استخراج
پس از استخراج DNA، کمیت و کیفیت DNA­ی استخراج شده، با بهره گرفتن از دستگاه نانو­دراپ (Nanodrop) مدل T100 و الکتروفورز روی ژل آگارز یک درصد بررسی شد.
۳-۳-۱ الکتروفورز DNA­ی استخراج شده روی ژل آگارز یک درصد

1. 1. مقدار ۱ گرم آگارز در ۱۰۰ میلی­لیتر بافر ۱X TAE حل و چند دقیقه جوشانده شد. بعد از اضافه کردن اتیدیوم برماید به محلول (رنگ محلول صورتی پوست پیازی شود)، درون سینی ژل که دو طرف آن بسته شده و شانه مخصوص روی آن گذاشته شده بود، ریخته شد.

1. 1. بعد از سرد شدن ژل، دو طرف سینی را باز کرده و شانه به آرامی خارج شد. ژل به همراه سینی در تانک دارای بافر ۱X TAE قرار داده شد. ارتفاع بافر باید به حدی باشد که سطح ژل را تا چند میلی­لیتر بپوشاند.

1. 1. مقدار ۴ میکرو­لیتر از DNA استخراج شده، با یک میکرو­لیتر بافر بارگذاری^[۲۴] آمیخته و به چاهک ژل انتقال داده شد.

1. 1. ولتاژ دستگاه در ۸۰ ولت تنظیم و برای ۹۰ دقیقه فرایند الکتروفورز انجام شد.

1. 1. پس از پایان الکتروفورز، ژل روی صفحه­ی U.V. Transilluminator بررسی و از آن عکس­برداری شد.

۳-۳-۲- تهیه بافر ۵۰x TAE

1. 1. مقدار ۲/۲۴۲ گرم تریس باز^[۲۵]، ۵۷ میلی­لیتر اسید استیک ۹۹ درصد و ۱۰۰ میلی­لیتر EDTA نیم مولار با pH 5/7 تا ۸، با هم مخلوط شدند.

1. 1. حجم محلول با بهره گرفتن از آب مقطر به یک لیتر رسید.

۳-۳-۳-تهیه بافرTAE 1X

1. 1. برای استفاده از بافر، باید غلظت آن از۵۰x به ۱x کاهش یابد. بدین منظور، ۲۰ میلی­لیتر از بافر ۵۰x با ۹۸۰ میلی­لیتر آب مقطر مخلوط شد و یک لیتر بافر ۱x بدست آمد.

۳-۴- واکنش­های زنجیره­ای پلیمراز^[۲۶](PCR)
۳-۴-۱- ژن هورمون رشد
برای ازدیاد قطعه­ی ۴۲۸ جفت بازی از اگزون ۵ ژن هورمون رشد از آغازگر­های ارائه شده در جدول ۳-۱ استفاده شد. در واکنش­های PCR از میکروتیوب­های ۲۵ میکرولیتری استفاده شد. مواد مورد استفاده در واکنش­های PCR در جدول ۳-۲ ارائه شده است و از دستگاه ترموسایکلر Eppendorf AG Master cycler Gradiant مدل ۲۳۳۳۱ استفاده شد. چرخه­های گرمایی مورد استفاده در PCR در جدول ۳-۳ نشان داده شده است.
جدول ۳-۱ – آغازگر­های استفاده شده در ازدیاد ژن هورمون رشد ( Lucy et al., 1993)

نام ژن