این روش راه سنتی و شدید استخراج روغن از گل است. این فرایند شامل لایه بندی چربی بر گلبرگهای گل است در مرحله بعد اسانس روغنی جذب میشود و بعد الکل جهت جدا کردن و استخراج اسانس از چربی استفاده میشود و در مرحله بعد الکل تبخیر شده و اسانس باقی میماند .( Making Essential Oils – Methods of Essential Oil Extraction: from the webpage)
۲-۶-۴- تقطیر آبی[۲۵]
تقطیر آبی به عنوان یک فرایند منسوخ در برخی از کشورهای در حال توسعه برای استخراج اسانس استفاده میشود. در نتیجه این فرایند احتمال سوختن ترکیبات آروماتیک و در نتیجه اسانس با بوی سوخته تولید میشود و یا بیش از حد گرم میشود. به نظر میرسد که تقطیر آبی برای مواد پودری و یا مواد بسیار سفت و سخت نظیر ریشه یا پوست مناسب است .( Making Essential Oils – Methods of Essential Oil Extraction: from the webpage)
( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )
۲-۶-۵- استخراج با CO2 و یا CO2 فوق بحرانی
این روش جزء مدرنترین فنآوریهاست که در آن از دیاکسید کربن به عنوان حلال استفاده میشود و اسانس را از میان سایر مواد گیاهی جدا میکند. فشار پایین استخراج با دی اکسید کربن شامل دیاکسید کربن خنک کننده با دمای ۳۵ و ۵۵ درجه فارنهایت و پمپاژ آن از میان مواد گیاهی با فشاری در حدود ۱۰۰۰ PSI است که تحت این شرایط دی اکسید کربن به مایع تبدیل شده است. در استخراج با CO2 فوق بحرانی دی اکسید کربن تا ۸۷ درجه فارنهایت حرارت داده میشود و با فشار ۸۰۰۰ PSI از میان مواد گیاهی پمپاژ میشود که در این شرایط دی- اکسیدکربن به بخار یا مه تبدیل میشود. با آزاد کردن و برداشتن فشار، دیاکسید کربن به حالت فرار درآمده و اسانس باقی میماند. نکته مهم در استفاده از این روش استفاده از فشار کم و درجه حرارت پایین است. درجه حرارت بالا، پردازش (فرآوری) سریع و استفاده از حلال ساختار مولکولی آن را تغییر داده و ارزش درمانی اسانس را تغییر داده یا نابود میکند .( Making Essential Oils – Methods of Essential Oil Extraction: from the webpage)
۲-۶-۶- تقطیر توربینی[۲۶]
توربو تقطیر مناسب برای استخراج مواد سخت یا مواد درشت دانه مانند پوست، ریشه و دانه است. در این روش گیاهان در آب خیسانده میشوند و بخار آب از میان مخلوط آب و گیاه به گردش در میآید. در تمامی مراحل کار آب به طور مداوم بازیافت شده و دوباره مورد استفاده قرار میگیرد .( Making Essential Oils – Methods of Essential Oil Extraction: from the webpage)
۲-۶-۷- تقطیر با بخار[۲۷]
رایجترین روش است که در آن اسانس گیاه با بهره گرفتن از تکنیک تقطیر استخراج میشود. بخار حاوی اسانس جمع میشود و پس از گذشت از منطقه خنک، جمع و متراکم میشود. سپس مخلوط آب و اسانس جدا میشود. از آنجا که گیاهان دارای مقادیر بسیار کمی اسانس هستند، مقادیر زیادی گیاه برای به دست آوردن اسانس آن ها مورد نیاز است .( Making Essential Oils – Methods of Essential Oil Extraction: from the web page)
شکل۲-۶ دیاگرام مربوط به تقطیر با بخار
شکل۲-۷ دیاگرام مربوط به تقطیر با آب
۲-۷- تاریخچه استفاده از اسانس
اگرچه ادویهجات برای عطر، بو و خواص نگه دارندهشان از ایام باستان مورد استفاده قرار میگرفتهاند اما تنها اسانس سقز توسط تاریخ دانان رومی و یونانی اشاره شده است. تبخیر یک روش تولید اسانس بوده که برای اولین بار در شرق (مصر، هند و ایران) در ۲۰۰۰ سال قبل و در قرن ۹ میلادی توسط اعراب مورد استفاده قرار گرفته است. اولین نوشته معتبر که تبخیر اسانس را نقل کرده است توسط Villonoval (یک فیزیکدان کاتالان) توصیف شده است. در قرن ۱۳ میلادی اسانسها توسط داروسازان شناخته شده و اثرات دارویی آن ها در فارماکوپه ها توصیف شد. اما استفاده آن ها به طور گسترده تا قرن ۱۶ میلادی در اروپا مشخص نشد. مقالات مجزا در آن قرن توسط دو فیزیکدان استراسبورگی، برانشویگ و رایف، تقطیر و کاربرد اسانسها را ذکر کردند. تعداد کمی از اسانسها مثل ترپانتین، چوب سرو، رزماری، اسطوخودوس، میخک، پوست جوز، درخت جوز، بادیان رومی و دارچین مطابق با نظر فیزیکدان فرانسوی Duchesne در قرن ۱۷ میلادی تهیه شدند. استفاده از روغن درخت چای برای اهداف پزشکی پس از مستعمره شدن استرالیا در قرن ۱۸ میلادی ثبت شده است. اگرچه عموماً توسط بومیان توسط بومیان استرالیایی قبلاً استفاده میشده است. اولین آزمایش که خواص ضد میکروبی اسانس را بیان کرد توسط Dela croix در ۱۸۸۱ میلادی انجام شد. هرچند در طول قرن ۱۹ و ۲۰ میلادی کاربرد اسانس برای دارو در اولویت ثانویه پس از استفاده برای عطر و طعم قرار گرفت (Burt, 2004).
۲-۸- کاربرد های امروزی اسانسها
بیشترین کاربرد امروزی اسانسها در اتحادیه اروپا در غذا (به عنوان طعم دهنده)، عطرها (خوشبو کننده و افترشیو) و داروها (برای خواص عملی شان) میباشد. ترکیبات اختصاصی اسانسها که به عنوان طعمدهنده غذایی استفاده میشوند، یا از مواد گیاهی استخراج میشوند به صورت سنتتیک تولید میشوند. اسانسها و ترکیباتشان به عنوان مواد ضد میکروبی، هم چنین در تولیدات تجاری گوناگون به عنوان روزنه گیرهای کانالهای ریشه دندان، آنتی سپتیک ها (گندزداها) و تزریق مکمل برای دوران شیردهی بکار میروند. تقریباً تعداد کمی نگه دارنده حاوی اسانسها به صورت تجاری در دسترس میباشند. DMC بر پایه طبیعی، یک نوع نگه دارنده غذایی تولید شده توسط DOMCA S.A ,Alhedin ,Granada ,Spain و شامل ۵۰ درصد اسانس رزماری ، Saga، لیمو و۵۰ درصد گلیسرول می شود (Burt, 2004).
Protecta oneو Protecta two مخلوط عصاره های گیاهی تولید شده توسط شرکت باواریا در آمریکا است و عموماً به عنوان یک افزودنی غذایی سالم (GRAS) در آمریکا طبقه بندی میشود. اگرچه ترکیبات دقیق توسط شرکت سازنده معرفی نمیشوند اما احتمالاً عصارهها شامل یک یا چند نوع اسانس میباشند و قابل حل در محلولها سیترات سدیم و کلرید سدیم میباشند. تأثیرات فیزیولوژیک بیشتر اسانسها، آن ها را به طور وسیع در تولیدات مختلف قابل استفاده میکند (Burt, 2004).
۲-۹- آزمایشات فعالیت ضد میکروبی در سیستمهای غذایی
اگرچه همان طور که قبلاً ذکر شد تعداد کمی مواد نگه دارنده مواد غذایی حاوی اسانسها به صورت تجاری موجود است. تا اوایل ۱۹۹۰ مطالعات خیلی کمی در خصوص فعالیت اسانسها در غذاها منتشر شده بود، از آن زمان تعداد خوبی از آزمایشات با اسانسها در مواد غذایی انجام گرفت. یک بازنگری مطالعات گذشته در مقالات در خصوص فعالیت ضد میکروبی در خصوص فعالیت ضد میکروبی اسانسها و ترکیبات آن ها در مواد غذایی آورده شده است. هر چند اسانسها در شرایط آزمایشگاهی اثر ضد میکروبی خوبی دارند، اما برای بروز همان اثر در غذا نیاز به غلظت بالاتر میباشد. نسبتهایی که ثبت شده، تقریباً ۲ برابر در شیر کم چرب،۱۰ برابر در سوسیس کبد خوک، ۵۰ برابر در سوپ، ۲۵ تا ۱۰۰ برابر در پنیرهای نرم میباشد. یک استثنا برای این پدیده باکتری آئروموناس هیدروفیلا که هیچ افزایشی در غلظت اسانس برای جلوگیری از رشد این گونه در خوک و کاهو در مقایسه با آزمایشات در شرایط آزمایشگاهی نیاز نمیباشد. چندین مطالعه در خصوص اثر مواد غذایی یا مقاومت میکروبی به اسانسها ثبت شدهاند کیفیت و مکانیسم آن مشخص نشده است، ولی پیشنهاداتی برای علتهای ممکن ارائه شده است. مواد غذایی قابل دسترس عمده در مواد غذایی به نسبت محیطهای کشت آزمایشگاهی، ممکن است باعث توانایی باکتریها برای اصلاح سریعتر سلولهای آسیب دیده شود. نه تنها عوامل درونی غذا (چربی، پروتئین، مقدار آب، آنتی اکسیدآن ها، نگه دارنده ها،Ph ، نمک و دیگر افزودنیها) میتوانند در حساسیت باکتری موثر باشند، بلکه عوامل خارجی (دما، بسته بندی در خلأ، گاز یا هوا و ویژگی میکروارگانیسم ها) میتوانند در حساسیت باکتری موثر باشند. در Ph پایین هیدروفوبیسیته یک اسانس افزایش مییابد و باعث میشد تا راحت تر در چربیهای غشاء سلول باکتری هدف حل شود. معمولاً گمان میشود که سطوح بالای چربی یا پروتئین در مواد غذایی باعث حفاظت باکتری در برابر اسانس در برابر بعضی موارد شود. برای مثال اگر اسانس در فاز چربی غذا حل شود، نسبتاً کمتر در دسترس خواهد بود تا بر روی باکتریهای موجود در فاز آبی اثر کند. پیشنهاد دیگر این است که مقدار آب موجود در ماده غذایی به نسبت محیطهای کشت آزمایشگاهی، ممکن است مانع پیشرفت عوامل ضد باکتری برای قسمتهای هدف در سلول باکتری شود. روغن نعناع[۲۸] در سالاد پت و ماهی رو[۲۹]، محصولات با چربی بالا اثر آنتی باکتریال کمتری بر روی لیستریا مونوسایتوژنز و سالمونلا انتریدیس دارد، در حالی که در سالاد ماست و خیار (چربی کم) همان اسانس بیشتر موثر است. اگرچه تأثیرات بهترش در سالاد ماست و خیار ممکن است که تا حد کمی به Ph پایین نسبت داده شود (۳/۴ در قیاس با ۸/۶ در پت) سالاد ماهی رو نیز یک Ph پایین دارد (۹/۴). به نظر میرسد که این مشخصه درصد چربی به نسبت Ph روی اثر ضد باکتری اسانسها تأثیر بیشتری نشان دهد (Burt, 2004).
واکنش بین کارواکرول یک ترکیب فنولیک متفاوت اسانس، و پروتئینها در شیر که به عنوان یک عامل محدود کننده در فعالیت ضد باکتری در برابر باسیلوس سرئوس در شیر عمل کرده است. مقدار پروتئین در پنیر کم چرب آبکی، به عنوان یک عامل ممانعت کننده در فعالیت روغن میخک بر روی سالمونلا انتریدیس عمل کرده است. کربوهیدراتها در غذا همانند چربی و پروتئین نمیتوانند از باکتریها در مقابل اسانسها محافظت کنند. میزان آب یا نمک بالا به عمل اسانسها کمک میکند. ساختمان فیزیکی یک غذا ممکن است باعث محدودیت فعالیت ضد باکتری اسانس شود. یک مطالعه مقایسه نسبت کارایی روغن پونه کوهی[۳۰] بر روی سالمونلا تیفی موریوم در محیط مایع و ژل ژلاتین مشخص کرد که ماتریکس ژل به طور واضحی اثر بازدارندگی اسانس را کاهش داد. این مسئله به علت محدودیت پخش اسانس به وسیله ساختمان ماتریکس ژل حتمی میباشد. MIC برای یک اسانس مشخص روی یک باکتری خاص در محیط براث معمولاً اندکی پایینتر از آگار میباشد. تحقیقات در خصوص مشخصات رشد لیستریا مونوسیتوژنز و یرسینیا انتروکولیتیکا در امولسیون روغن در آب نشان داد که بسته به میانگین سایز قطره امولسیون، باکتری میتواند در فیلمها، در کلنیها یا سلولهای پلانکتونیک رشد کند. مشخص شده که رشد کلنی محدود به پخش اکسیژن میشود و سلولهای واقع در کلنی ممکن است با مقدار معینی از سلولهای خارجی سوبسترا در امولسیون محافظت شوند. اگر قطرات روغن در یک امولسیون غذایی سایز مشخص داشته باشند. ممکن است بتوانند مانع از عمل اسانسها بر رشد باکتری و محافظت و محافظت آن ها در کلنیها شوند .(Burt, 2004)
۲-۹-۱- گوشت و فرآورده های آن
اسانسهای اوژنول، گشنیز، میخک، پونه کوهی و آویشن در سطوح ۵ تا ۲۰ میکرو لیتر برگرم در برابر باکتریهای لیستریا مونوسایتوژنز، آئروموناس هیدروفیلا و سایر عوامل فساد خودبخودی محصولات گوشت و فلور طبیعی آن ها موثر واقع شد، درحالیکه خردل، نعناع و مریم گلی به میزان کمتری موثر بوده یا بیاثر بودند. به نظر میرسد که محتوای چربی بالا عمل اسانسهای روغنی را در محصولات گوشتی کاهش میدهد. به عنوان مثال اسانس نعناع و گشنیز در موادی که دارای سطوح بالایی از چربی (۳۵ تا ۴۰ درصد چربی) از قبیل ژامبونهای پوشش داده شده با روغن کانولا موثر واقع نشد .(Ultee et al, 2000)
فعالیت اسانس پونه نیز بر علیه اسپور های کلستریدیوم بوتولینوم در بسته های گوشت بسته بندی شده در خلأ مورد مطالعه قرار گرفته است. غلظتهای ۴/۰ میکرولیتر بر گرم اسانس پونه تا حدود زیادی مانع از رشد اسپور ها و یا به تأخیر انداختن رشد آن ها میشود. با این حال استفاده از سطوح پایین نیتریت سدیم که باعث به تأخیر انداختن رشد و تورم باکتری میشود در صورتی که به طور همزمان از نیتریت سدیم و اسانس پونه استفاده شود کاربرد و اثر آن ها در جلوگیری از رشد باکتریها به میزان قابل توجهی افزایش مییابد. البته تأخیر در رشد به مقادیر اسپور تلقیح شده دارد و در مقادیر ۳۰۰ اسپور در گرم، تأخیر بیشتری نسبت به ۳۰۰۰ اسپور در گرم نشان میدهد .(Skandamis and Nychas, 2001 and Gill et al, 2002)
۲-۹-۲- ماهی
ماهیهایی نیز که مانند محصولات گوشتی دارای محتوای چربی بالایی هستند، اثر آنتی باکتریال اسانسها را کاهش میدهند. به عنوان مثال غلظتهای ۵/۰ میکرو لیتر بر گرم از اسانس پونه کوهی بیشتر روی فوتو باکتریوم فسفریوم در فیله ماهی به میزان بیشتری نسبت به ماهی سالمون موثر است، زیرا سالمون دارای محتوی چربی بیشتری است. پونه کوهی نیز نسبت به روغن نعناع با انجام دو آزمایش به صورت تجربی و استفاده از غلظتهای مشابه ۵ تا ۲۰ میکرولیتر بر گرم مؤثرتر واقع شد .(lemay et al, 2002 and Harpz et al, 2003)
۲-۹-٣- محصولات شیری
روغن نعناع در غلظتهای ۵ تا ۲۰ میکرولیتر در گرم در برابر سالمونلا انتریدیس در ماست کم چرب و سالاد خیار موثر واقع شد. روغن نعناع هم چنین در غلظتهای ۰۵/۰ تا ۵ میکرولیتر در گرم مانع از رشد گونه های کشت آغازگر در ماست میشود اما دارچین، هل و میخک در این مورد بسیار مؤثرتر واقع میشوند.(Mejlholm and Dalgaard, 2002)
۲-۹-۴- سبزیجات
سبزیجات بطورکلی به دلیل داشتن محتوی چربی پایین، اثرات اسانس و عصارهها در مورد آن ها میتواند نتایج موفقیتآمیزتری به دنبال داشته باشد به نظر میرسد که در غذاهای گیاهی درست مانند محصولات گوشتی، فعالیت ضد میکروبی اسانسهای روغنی از طریق کاهش دمای نگه داری افزایش اسیدیته در غذا مؤثرتر واقع شود. اکثر اسانسها و ترکیباتشان که بر روی سبزیجات مختلف آزمایش شدهاند علیه فلور طبیعی و پاتوژن های منتقله از راه مواد غذایی در سطوح ۱/۰ تا ۱۰ میکرولیتر بر گرم از طرق شستشوی آن ها در آب موثر باشد. روغن پونه کوهی در غلظتهای ۷ تا ۲۱ میکرولیتر بر گرم مانع از رشد E.coli O157:H7 میشود و نیز کاهش جمعیت آن ها در سالاد
بادمجان نسبت به نمونه های شاهد میشود .(Seneiirathne et al, 2006)
۲-۹-۵- برنج
روغن و اسانس مریم گلی در غلظتهای ۲/۰ تا ۵/۰ میکرولیتر بر گرم زمانی در برابر باسیلوس سرئوس در برنج استفاده شد بیاثر بود اما زمانی که از غلظتهای ۱۵/۰ تا ۷۵/۰ استفاده شد در کاهش جمعیت نهایی و طویل نمودن فاز تأخیر در مقایسه با یک گروه کنترل موثر بود .(Tassou et al, 1995)
۲-۹-۶- میوهها
کاواکرول[۳۱] و سینامالدهید در کاهش فلور طبیعی کیوی زمانیکه از غلظتهای ۱۵/۰ میکرو لیتر بر گرم آن ها استفاده میشود بسیار موثر بودند اما در برابر شکرک خربزه به میزان کمتری موثر بودند. البته این امکان وجود دارد که این تفاوت با تفاوت بین Ph میوهها که در کیوی ۲/۳ تا ۶/۳ بوده ولی در خربزه بین ۴/۵ تا ۵/۵ است، قابل توجیه باشد. زیرا همان طور که قبلاً ذکر شد اثر آنتی باکتریال اسانسهای روغنی در Ph های پایین به میزان قابل توجهی بهبود مییابد .(Singh et al, 2002)
۲-۱۰- طرز عمل فعالیت ضد باکتری
با در نظر گرفتن تعداد زیاد گروه های مختلف ترکیبات شیمیایی حاضر در اسانسها، بیشترین احتمال این است که فعالیت ضد باکتری آن ها قابل استناد به یک مکانیسم خاص نیست، اما چند هدف در سلول وجود دارد. محلها یا مکانیسمها در سلول باکتری در شکل زیر مشخص شده است.
شکل ۲-۸ محل و مکانیسم فعالیت اسانسها در سلول باکتری
این مکانیسمها نه تنها هدفها را جدا میکنند، تعدادی تحت تأثیر دیگر مکانیسمهای هدفگذاری شده هستند. یک مشخصه مهم اسانسها و ترکیباتشان آب گریزی آن هاست که آن ها را قادر میکند تا با جدا کردن لیپید های دیواره سلولی و میتوکندری باکتریایی، ساختمانشان را مختل کند و نفوذ پذیری بیشتر آن ها را آماده کند. تراوش یونها و دیگر محتویات سلولی میتواند رخ دهد. اگرچه مقدار معینی تراوش از سلولهای باکتریایی بدون کاهش زیست پذیری ممکن است تحمل شود، اما کاهش وسیع مقادیر سلولی یا خروج مولکولهای بحرانی و یونها منجر به مرگ خواهد شد. از مطالعات با روغن چای و اشرشیاکلای مدارکی وجود دارد که مرگ سلول ممکن است قبل از زوال سلول رخ دهد. عموماً اسانسهای واجد شرایط از نظر خواص ضد باکتری در برابر پاتوژن های با منشاءغذایی حاوی درصد بالایی ترکیبات فنولیک مانند کارواکرول، ائوگنول (۲- متوکسی-۴-(۲-پروپنیل)فنول) و تیمول میباشند. این معقول به نظر میرسد که مکانیسم عمل آن ها مشابه دیگر فنولیکها باشد.(Ultee et al, 2000 and Roller and Seedhar, 2000)
به طور کلی اختلال در غشای سیتوپلاسمی، اخلال در نیروی محرکه پروتون(PMF) جریان الکترونی، حمل و نقل فعال و انعقاد محتویات سلولی مدنظر میباشد. ساختمان شیمیایی منحصر به فرد ترکیبات شیمیایی اسانس بر حالت دقیق عمل و فعالیت ضد باکتریایی اثر میگذارند. اهمیت وجود گروههای هیدروکسیل در ترکیبات فنولیک مانند کارواکرول و تیمول تایید شده است. موقعیت نسبی گروه فنولیک با تأثیر بر درجه فعالیت ضد باکتریایی به شدت ظاهر نمیشود. برای مثال عمل تیمول در برابر باسیلوس سرئوس، استافیلوکوکوس اورئوس و سودوموناس آئروژنزا در قیاس با کارواکرول ظاهر میشود. با این حال در یک مطالعه عمل متفاوت کارواکرول و تیمول روی باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی یافت شد. اهمیت حلقه فنل (بی ثبات کننده الکترونها) به تنهایی عدم فعالیت منتول در قیاس با کارواکرول را نشان میدهد. در مطالعهای دیگر اضافه کردن یک قسمت استات به مولکول با افزایش فعالیت ضد باکتری همراه بود. گرانیل استات به نسبت گرانیول در برابر یک رنج از باکتریهای گرم منفی و گرم مثبت بیشتر فعال بود. از آنجا که ترکیبات غیرفنولیک اسانسها اهمیت دارند نوع گروه آلکیل نیز در فعالیت آن ها تأثیر میگذارد .(Carson et al, 2002 and Pol et al, 2001)
ترکیبات اسانس هم چنین نشان دادند که بر روی پروتئینهای سلولی جاسازی شده در لایه سیتوپلاسمی عمل میکنند. آنزیمها مانند ATPases با تعیین در لایه سیتوپلاسم و مجاورت با مولکولهای لیپید شناخته میشوند. دو مکانیسم ممکن پیشنهاد شده است که به موجب آن هیدروکربنهای حلقوی روی این میتوانند عمل کنند. مولکولهای هیدروکربنهای چربی دوست میتوانند در چربی دو لایه انباشته شده و عمل چربی-پروتئین را مختل کنند و از طرف دیگر واکنش مستقیم ترکیبات چربی دوست با قسمتهای آب دوست پروتئین ممکن است صورت بگیرد. مشخص شده که تعدادی از اسانسها باعث تحریک رشد شبه مسیل در مخمرهای حقیقی میشوند .(Dorman and Deans, 2000)
۲-۱۱- حساسیت ارگانیسمهای گرم مثبت و گرم منفی
بر اساس مطالعات و تحقیقات انجام شده، عمل تمام اسانسها بر ارگانیسمهای عامل فساد مواد غذایی و پاتوژن های بیماریزای مواد غذایی نشان میدهد که اسانسها اندکی بیشتر بر باکتریهای گرم مثبت نسبت به باکتریهای گرم منفی موثرند. انتظار میرود که ارگانیسمهای گرم منفی کمتر به عمل آنتی باکتریال ها حساس باشند، که این در نتیجه داشتن یک لایه بیرونی در اطراف دیواره سلولی بوده که این لایه مانع پخش ترکیبات آب دوست به واسطه پوشش لیپوساکاریدیش میشود. اکثر مطالعات استنتاج کردهاند که باکتریهای گرم مثبت حساسترند. آئروموناس هیدروفیلا (گرم منفی) نشان داده که یکی از حساسترین گونههاست. در مطالعه اسانس نعناع فلفلی[۳۲] وقتی تراموسالاتا[۳۳] و تزاتزیکی[۳۴] ، اشتهاآورهای یونانی اضافه شدند یک کاهش در مقدار شمارش زنده سالمونلا انتریدیس نسبت به لیستریا مونوسیتوژنز حاصل شد. در دیگر مطالعات هیچ اختلافی بین گرم منفیها و گرم مثبتها بعد از ۲۴ ساعت مشاهده نشد، اما اثر بازدارندگی بعد از ۴۸ ساعت بر گرم منفیها بیشتر از گرم مثبتها بود. در یک آزمایش ۵۰ اسانس تجاری در دسترس بر روی ۲۵ جنس، هیچ مدرکی برای اختلاف در حساسیت باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی یافت نشد. در مطالعهی بعدی که همان روش آزمایش و همان باکتریها مورد آزمایش قرار گرفتند و ظاهراً از اسانس تازه تقطیر شده استفاده شده بود باکتریهای گرم مثبت در واقع حساسیت بیشتری نسبت به دو اسانس داشته و حساسیت به چهار اسانس دیگر با گونه های گرم منفی مساوی است. این منطقی به نظر میرسد که ترکیبات منحصر به فرد اسانسها درجات مختلف بازدارندگی فعالیت در برابر باکتریهای گرم مثبت و منفی دارند و معلوم میشود که ترکیبات شیمیایی اسانسها از گونه های گیاه خاص میتواند بسته به منشأ جغرافیایی و دوره برداشت متفاوت باشد. بنابراین امکان دارد که تفاوت در ترکیبات بین بچ های اسانسها، به علت اختلاف در درجه حساسیت باکتریهای گرم منفی و گرم مثبت معنی دار باشد. باکتریهای گرم منفی سودوموناس به خصوص سودوموناس آئروژینوزا، کمترین حساسیت به عمل اسانس نشان داد .(Burt, 2004)
۲-۱۲- سینرژیسم و آنتاگونیسم بین ترکیبات اسانس
فعالیت ذاتی یک روغن میتواند مربوط به ساختمان شیمیایی ترکیبات، مقادیر نسبی آن ها در ترکیب و ارتباط بین آن ها باشد. در افزودنیهای مشاهده شده است وقتی افزودنیها ترکیب میشوند اثرش برابر است با مجموع اثرات فردی آنتاگونیسم وقتی مشاهده میشود که اثرات یک یا هر دو ترکیب زمانی که آن ها با هم بکار میروند کمتر از وقتی باشد که آن ها به صورت تک تک مورد استفاده قرار میگیرند. سینرژیسم هم زمانی مشاهده میشود که اثر مواد ترکیب شده بیشتر از مجموع اثرات فردی یک ترکیب باشد. تعدادی از مطالعات به این نتیجه رسیدند که تمام اسانسها فعالیت ضد باکتری بزرگتری نسبت به مخلوط اصلی ترکیبشان دارند، و اعتقاد بر این است که ترکیبات جزئی برای فعالیت ضد باکتری مهماند و ممکن است که یک اثر سینرژیستی یا اثر قوی داشته باشند. اسانسهای سیلانترو[۳۵]،گشنیز[۳۶] ، شوید[۳۷] و اکالیپتوس[۳۸] هر کدام شامل چندین ترکیب هستند و زمانی که با هم بکار میروند در مجموع دارای اثرات یا آنتاگونیستی بودند. یک مخلوط سینامالدهید و اوژنول به ترتیب در ۲۵۰ میکروگرم در لیتر و ۵۰۰ میکروگرم در لیتر کاملاً مانع رشد گونه های استافیلوکوکوس، میکروکوکوس، باسیلوس و انترو باکتر برای بیشتر از ۳۰ روز گردیدند، در حالی که ترکیبات مورد نظر به طور مجزا نتوانستند مانع رشد بشوند .(Nychas, 1995)
۲-۱۳- سینرژیسم و آنتاگونیسم بین ترکیبات اسانس و نگه دارنده های مواد غذایی
تعدادی از سینرژیست ها به طور بالقوه برای استفاده همراه با اسانسها پیشنهاد شده است که عبارتند از:Ph پایین، فعالیت آبی کم، شلات کنندهها، فشار اکسیژن پایین، گرمای خفیف و بالا. ولی تمام اینها در مواد غذایی تحقیق نشده است و قسمت دیگر مطالعات میتواند روی اثر اسانس یا ترکیباتشان با بعضی از افزودنیهای غذایی از قبیل: نمک طعام، نیتریت سدیم، نایسین و یا استفاده از تکنیکهای نگه داری مواد غذایی از قبیل: فرایند حرارتی ملایم، فشار هیدرو استاتیک و یا بسته بندی در خلأ میباشد ( .(Carson et al, 2002
کلرید سدیم (نمک طعام) در شرایط مختلف با اسانس یا ترکیباتشان یک سینرژیست یا آنتاگونیست عمل کرده است. سینرژیست بین نمک طعام و روغن نعناع بر علیه سالمونلا انتریدیس و لیستریا مونو سایتوژنز ثبت شده است. ترکیب ۲ یا ۳ درصد نمک طعام و نیم درصد پودر میخک (شامل اوژنول و استات اوژنول) در عصاره ماهیچه ماکرل کاملاً از رشد و تولید هیستامین توسط انتروباکتر آئروژنز جلوگیری میکند. مکانیسم پیشنهاد شده برای این عمل این است که نمک طعام نفوذ پذیری سلولی را افزایش میدهد و با عمل آنزیمهای خارج سلولی مانع رشد میشود. اثرات آنتاگونیستی نمک طعام با کارواکرول و p-cymene بر علیه باسیلوس سرئوس در برنج یافت شد با اینکه کارواکرول و p-cymene با هم سینرژیست هستند ولی با افزودن نمک (۲۵/۱ گرم برای هر لیتر برنج) کاهش یافت. در همان مطالعه اثر سینرژی با کارواکرول نشان داد، هرچند این سینرژی با حضور نمک طعام بطورکلی از بین نرفت ولی افزودن نمک به مقدار ۴ درصد وزنی حجمی در آگار نمیتواند فعالیت ضد باکتری سینامالدهید را بر علیه گرم مثبت و گرم منفی بهبود دهد .(Moleyer and Narasimhan, 1992)
ترکیب اسانس پونه کوهی با نیتریت سدیم به جهت تأثیرش روی رشد و تولید توکسین کلستریدیوم بوتولینوم (ترکیبی از نوع A و B و C) آزمایش شده است. روغن پونه کوهی با نیتریت در بازدارندگی رشد در محیط براث به صورت سینرژیست عمل کرده است. در حالی که روغن پونه کوهی با غلظت ppm۴۰۰ هیچ اثر بازدارندگی معنیداری بر رشد نداشت. مکانیسم سینرژیسم پیشنهادی اسانس پونه کوهی این است که تعداد اسپورهای جوانه-زده ای را میکاهد که نتیجه مهار رشد اسپورها توسط نیتریت سدیم هستندBurt, 2004) ). کاربرد همزمان نایسین (۱۵/۰ میکروگرم بر لیتر) و کارواکرول یا تیمول (۴۵ میکروگرم بر لیتر) باعث کاهش زیادتر در مقادیر زنده نژادهای باسیلوس سرئوس نسبت به زمانی که باکتریها به تنهایی بهکار گرفتند شد. ماکزیمم کاهش زنده ماندن در سلولهایی به دست آمد که قبلاً حرارت ۴۵ درجه را تجربه کرده بودند (۵ دقیقه برای سلولها در فاز رشد و ۴۰ دقیقه برای سلولها در فاز ثابت( .(Karatzas et al, 2000)
مشخص شد که کاروان نه تنها حساسیت سلولهای رویشی باسیلوس سرئوس را به PEF (میدان های الکتریکی پالسی) افزایش میدهد، بلکه حساسیت اسپورهایشان را به نایسین یا PEF افزایش میدهد. در Ph=7 عمل سینرژیستی نایسین و کارواکرول در ۳۰ درجه سلسیوس به طور معنیداری بیشتر از ۸ درجه سلسیوس بود، که نشان میدهد افزایش تغییرات دما در نفوذ پذیری لایه سیتوپلاسمی موثر است. قبلاً فرض شده بود که کارواکرول ممکن است تعداد، اندازه یا طول عمر منافذ به وجود آمده توسط نایسین را در لایه سلول افزایش دهد ولی بعداً مشخص شد که اینطور نیست. مکانیسم ممکن است باعث اتلاف پتانسیل ممبران و کاهش گرادیان Ph و ATP خارج سلولی شود. تاثیر ترکیب کارون[۳۹]در غلظت ۵ میلی مول بر لیتر و عملیات حرارتی ملایم (۴۵ درجه به مدت ۳۰ دقیقه) روی سلولهای در حال رشد باکتری لیستریا مونوسیتوژنز رشد کرده در ۸ درجه به صورت لگاریتمی مطالعه شده است. ثابت شد که هر فرایند به طور جداگانه تأثیری در کاهش زنده ماندن باکتری ندارد اما وقتی آن ها باهم ترکیب شدند در تعداد سلولهای زنده یک کاهش ۳/۱ لگاریتمی ثبت شد. سلولهای رشد کرده در ۳۵ یا ۴۵ درجه به همان عملیات ترکیبی حساس نبودند. محققین فرض کردند که ترکیبات فسفولیپید لایه سیتوپلاسم سلولهای رشد کرده در ۸ درجه سلسیوس به علت داشتن سیالیت و نوع عملشان در دمای پایین، واجد شرایط غیر اشباعی بیشتری هستند. این میزان غیر اشباعیت بالا باعث میشود که لایه های این سلولها در ۴۵ درجه سیالیت بیشتری نسبت به سلولهایی که در همین دما رشد کردهاند داشته باشند .(Burt, 2004)
