جهت آبگیری مقاطع بافتی از رقت های مختلف اتانول ونهایتاً الکل مطلق استفاده شد.
۲-۸-۳- مرحله شفاف کردن[۳۰]
بافت ها در دو ظرف حاوی گزیلول هر کدام به مدت یک ساعت قرار داده تا گزیلول جایگزین الکل شود و بافت ها شفاف گردد.
۲-۸-۴- مرحله جایگزینی
بافت ها در دو ظرف حاوی پارافین مذاب با درجه حرارت ۵۶ درجه سانتی گراد هر کدام به مدت یک ساعت قرار داده شد تا پارافین در بافت نفوذ کند. با جایگزینی پارافین بجای مواد شفاف کننده بافت آماده قالب گیری گردید و سپس برش داده شد.
۲-۸-۵- مرحله قالب گیری[۳۱]
کمی پارافین مذاب را کف قالب ریخته و بافت را توسط پنس در کف قالب قرار داده ، سپس با تعیین سطح برش و پر کردن بقیه قالب قبل از سرد شدن شماره مشخصه نمونه را بر روی آن قرار داده تا با نمونه های دیگر پس از قالب گیری اشتباه نگردد. قالب ها در آب سرد قرار داده شدند تا سریع تر جامد گردند. سپس قالب به طریقی که کمترین صدمه ای به آن وارد گردد از پارافین جدا گردید. سپس پارافین های اضافی را از اطراف نمونه توسط اسکالپل برداشته و سعی شد که قالب کاملا کوچک باشدو پارافین کمی در اطراف بافت باقی بماند. برای جلوگیری از چسبندگی قالب با پارافین قبل از قالب گیری، قالب ها با گلیسیرین آغشته گردیدند.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
۲-۸-۶– برش بافت
از دستگاهی به نام میکروتوم برای برش بافت ها استفاده شد که اساس کار آن حرکت قالب های نمونه در مقابل تیغه بسیار تیز آن است که حرکت هر بار آن بر حسب ضخامت تعیین شده ورقه بسیار نازکی به اندازه چند میکرون (۶-۵ میکرون ) از آن بریده شد.
۲-۸-۷- چسبانیدن برش ها بر روی لام
این عمل بایستی با دقت زیادی انجام شود و شامل مراحل ذیل بود:
– ثبت شماره مشخصات نمونه در کنار لام
– تمیز کردن لام ها در محلول اسید الکل
– کشیدن ماده چسبنده روی لام که برش را بر روی آن ثابت نماید
۲-۸-۸- استقرار برش ها بر روی لام
برش ها را بر روی حمام آب گرم با دمای ۵ درجه کمتر از نقطه ذوب پارافین قرار داده شد تا چروک های برش باز شوند و سپس لام را با زاویه ۴۵ درجه در زیر آن وارد نموده و برش از حمام آب گرم خارج گردید و یا اینکه آنها را مستقیم روی لام و سپس بر سطح صفحات حرارتی مناسب توسط قطره ای از آب مقطر خشک و ثابت شدند.
۲-۸-۹- خشک کردن و نگهداری لام ها
برای نگهداری لام ها از گرمخانه ۳۷ درجه سانتیگراد تا زمان رنگ آمیزی استفاده گردید.
۲-۸-۱۰- روش رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین
پس از قرار دادن برش روی لام و خشک شدن اسلایدها از مواد زیر عبور داده شدند.
گزایلول ۱← ۳ دقیقه
گزایلول ۲←۳ دقیقه
گزایلول ۳ ←۳ دقیقه
الکل اتانول ۱۰۰← ۳ دقیقه
الکل اتانول ۹۵← ۳دقیقه
الکل اتانول۹۵ ← ۳ دقیقه
آب مقطر ← ۳ دقیقه
هماتوکسیلین ← ۱۵ دقیقه
شستشودر آب جاری ← ۱ دقیقه
ائوزین ← ۳ – ۵ دقیقه
الکل ۹۵ ←۳ دقیقه
الکل ۹۵←۳دقیقه
الکل۱۰۰← ۳ دقیقه
الکل ۱۰۰← ۳ دقیقه
گزایلول ۱← ۳ دقیقه
گزایلول ۲← ۳ دقیقه
۲-۸-۱۰-۱- آماده کردن رنگ آمیزی برش ها
جهت رنگ آمیزی برش ها دقت در نکات زیر لازم و ضروری است.
۲-۸-۱۰-۲- زدودن مواد مختلف در برش ها
-زدودن فرمالین و پارافین
برش ها به ترتیب از محلول های گزایلول، الکل مطلق اول و دوم هر کدام یک تا سه دقیقه عبور داده شدند.
– زدودن پارافین
برش ها در محلول گزایلول به مدت ۲ تا ۳ دقیقه و سپس در دو ظرف الکل مطلق هر کدام ۱ تا ۲ دقیقه قرار داده می شدند.
– زدودن مواد جیوه ای و پارافین
محلول های مورد استفاده به ترتیب عبارتند از :گزایلول ۲ تا ۳ دقیقه، الکل مطلق اول و دوم هر کدام ۱ تا ۲ دقیقه، الکل ۵۰% ، شستشو در آب روان هر کدام ۱ تا ۲ دقیقه ، یدلوگل ۲ تا ۳ دقیقه ، شستشو در آب، محلول تیوسلفونات سدیم (تا بیرنگ گردد) و شستشو در آب روان ۵ تا ۱۰ دقیقه
۲-۸-۱۰-۳- آب گیری
برای آب گیری از ۴ حمام الکل به ترتیب الکل ۹۵% دو ظرف و الکل مطلق دو ظرف، هر کدام ۱ تا ۲ دقیقه .
۲-۸-۱۰-۴- شفاف کردن
برای شفافیت و گرفتن الکل از برش های رنگ شده بایستی آنرا از دو حمام گزایلول هر کدام ۱ تا ۲ دقیقه گذرانیده شدند.
۲-۸-۱۱- چسباندن
در این مرحله برش های روی لام بوسیله قطره ای از نشاسته یا آلبومین پوشانیده و لامل بر روی آن قرار گرفت. دقت کافی به عمل آمد تا حباب هوا بین لام و لامل ایجاد نگردد. پس از خشک شدن لام ها جهت مطالعه میکروسکوپی آماده شدند.
